[发明专利]一种细胞自噬监测探针及其制备方法和用途

说明书

本发明公开了一种细胞自噬监测探针及其制备方法和用途，其细胞自噬监测探针的结构如下：通过细胞共定位实验确定其能专一的定位于溶酶体上，双光子荧光显微成像实验表明本发明细胞自噬监测探针对MCF‑7及Hela细胞等渗透性都较好，并能对溶酶体极性的变化适于细胞内定位于溶酶体及检测溶酶体极性的变化情况。本发明细胞自噬监测探针可以通过即时检测溶酶体内极性的变化来监测细胞的自噬过程。

一、技术领域

本发明涉及一种双光子荧光探针，具体地说是一种细胞自噬监测探针及其制备方法和用途。

二、背景技术

自噬是细胞在受到营养缺乏、氧化应激、高温、损伤等刺激信号时，由一种游离双层膜包裹细胞液或受损的细胞器形成自噬体，并与溶酶体结合形成自噬溶酶体，将内容物降解为氨基酸、核苷酸、游离脂肪酸从而维持细胞自身稳态效益的过程。自噬可分为4个部分，包括：诱导，自噬小体的形成，自噬小体和溶酶体的膜融合以及自噬溶酶体的降解。细胞自噬作为生物体中一种非常重要的代谢途径，调控过氧化物酶体、线粒体和内质网的不断更新，还能清除胞质内受损的细胞器和代谢产物，进行亚细胞水平的重构，保护受损细胞。目前，一些经典的监测自噬的手段大多基于生物学的角度，如扫描电镜(TEM)，蛋白免疫印迹(Western Blot)和荧光标记蛋白(GFP-Atg8/LC3)等。这些传统的监测手段都有着其局限性，如扫描电镜和蛋白免疫印迹，它们不能监测活细胞里的自噬状态，同时，这些方法操作都很复杂，花费也很昂贵，对细胞自噬的监测也不是特别的形象。因此，一种能够准确而又经济的自噬监测方法对自噬过程的研究十分必要。

溶酶体是真核细胞中的一种细胞器，内含多种水解酶，专司分解各种外源和内源的大分子物质。在自噬过程中，自噬体的膜会和溶酶体膜发生融合，使自噬体内包裹的物质与溶酶体内的水解酶相接触。在这个膜融合的过程中，溶酶体的微环境势必会发生变化，而这个过程中微环境信号的变化为我们提供了一个监测自噬过程的新思路。

极性是微环境中的一种重要参数，一些特定的无机有机反应均依赖于极性的参与。在生物系统里，尤其在细胞层面上，极性决定了大多数蛋白质和酶的联系并反映了细胞及细胞器膜组分的通透性，甚至极性的反常变化与一些疾病的产生关系密切。荧光探针是在一定体系内，当一种物质或体系中某一物质性质发生变化时，荧光信号能发生相应改变的分子。荧光光谱由于其检测方便，灵敏等优点在痕量检测中展现了优越的性能。近些年来，双光子荧光光谱凭借着自身稳定性高，光漂白性好，细胞穿透性高等优点被广泛使用。因此，能够使用双光子荧光探针来检测细胞溶酶体内极性的变化从而实现监测自噬是非常理想的选择。

三、发明内容

本发明旨在提供一种细胞自噬监测探针及其制备方法和用途。所要解决的技术问题是通过分子设计遴选合适的荧光探针结构，以实现双光子成像定性检测细胞中溶酶体的微环境变化，具有选择性专一、灵敏度高等优点，细胞毒性测试表明本发明对细胞几乎没有毒性作用。

本发明细胞自噬监测探针(Lyso-OSC)，是以香豆素为母体，4-甲氧基苯乙烯为供电子基团，2-吗啡-1-乙胺为溶酶体定位基团，简称为荧光探针或荧光探针分子，其结构由下式表示：

Lyso-OSC

本发明细胞自噬监测探针的制备方法，包括如下步骤：

将7-((4-甲氧基苯基)乙烯)-3-羧酸-香豆素(1g，3mmol)、N,N-二异丙基乙胺(1.2g，9mmol)、1-羟基苯并三唑(0.65g，4.5mmol)、EDC·HCl(0.65g，3.3mmol)以及2-吗啡-1-乙胺(1.2g，9mmol)加入史莱克瓶中，在无水无氧条件下加入30mL N,N-二甲基甲酰胺，室温下搅拌反应24h；反应结束后先向反应液中加入50mL二氯甲烷将反应物溶解，再用30mL水萃取(3次)，得到有机相，通过柱层析200-300目硅胶(洗脱液由乙酸乙酯和石油醚按体积比1:1混合构成)，得到目标产物Lyso-OSC 0.35g，产率40％。