[发明专利]microRNA检测探针组与microRNA的检测方法

说明书

本发明涉及分子检测技术领域，尤其涉及microRNA检测探针组与microRNA的检测方法。本发明提供了用于microRNA检测探针组与microRNA的检测方法，该探针组设计合理，利用链替换反应使得荧光信号得到级联放大，从而实现了对细胞内miRNA的检测。该方法无需严格的操作条件，操作简单，特别是在miRNA分子低表达的细胞或者组织中具有非常好的优势。解决了在之前的检测技术中存在检测体系中信号分子输出中伴随着目标链损失的巨大困难。实验表明，采用本发明提供的探针对miRNA进行检测，能够使荧光信号在1h左右达到最高，且最大程度避免了荧光信号泄露现象的产生。

技术领域

本发明涉及分子检测技术领域，尤其涉及microRNA检测探针组与microRNA的检测方法。

背景技术

MicroRNA(miRNA)是一类内生的、长度约为19-24个核苷酸的非编码单链RNA分子。由于miRNA能够很好的识别并配对后转录基因进而调控蛋白的表达，所以它与动物体内的生物过程息息相关。目前已经有研究表明：miRNA的异常行为会导致疾病的出现，包括心血管疾病，神经发育失常，甚至癌症[Nature,2012,482,347.]。例如miRNA-32的过表达是前列腺癌的基础的重要标志物[Oncogene 2012,31,4460.]，miRNA-122也被作为肝癌细胞发病的一个基础标志物[J.Am.Chem.Soc.2010,132,7976.]。所以在癌症的诊断以及治疗过程中miRNA的浓度都是一个重要的生物指标。

目前，通用的miRNA检测方法有qRT-PCR，Northern blot，寡核苷酸微阵列[Chem.Rev.,2013,113,6207.]，其中Northern Blotting是最经典的miRNA检测手段，但是它本身检测灵敏度较低，并且需要大量的样品。而微阵列具有高通量检测的优势，但是检测需要的时间很长，并且精度不高。qRT-PCR检测手段具有高精度，高灵敏度的特点，但是需要长时间的扩增步骤并且对操作人员具有一定的技能要求，这在实时检测中是一个很大的问题。但是上述方法最大的一个问题是所有的实验都是基于细胞裂解处理，无法实时的反映出肿瘤组织及肿瘤细胞内部真实的miRNA的作用机制。

因此为了能更加深入了解miRNA在细胞内调控基因表达的真实信息以及探索miRNA在细胞内的反应的动态过程，实现细胞内的miRNA的检测则尤为重要。现如今体内miRNA检测手段主要分为原位杂交技术和动态成像技术。在动态成像技术中基于分子信标成像是一个非常重要的手段。借助特殊的转染技术将荧光标记的分子信标导入细胞内，分子信标与目标miRNA分子配对后发生结构的转变会导致荧光信号的出现，最终实现miRNA的检测。[Biomaterials,2012,33,6430.]但是这些技术中存在一个明显的问题就是每次的信号分子的输出都伴随着目标分子的消耗。而在肿瘤细胞或肿瘤组织中的miRNA分子表达非常的有限，所以上述的技术在实现肿瘤组织活细胞内miRNA分子的检测具有很大的限制。

因此，为了克服现有技术中细胞内miRNA分子检测的困难，本发明人进行了深入研究，发现利用级联的DNA链替换反应实现肿瘤细胞或组织内microRNA检测具有简单操作，可以实现低浓度检测等特点，但是，如何避免级联DNA链替换反应过程中发生的荧光信号的泄露现象，仍是本领域亟待解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供microRNA检测探针组与microRNA的检测方法，本发明提供的探针设置合理，能够有效避免荧光信号的泄露，提高检测的特异性。

本发明提供的检测microRNA的探针组，由4条DNA探针组成，分别为：基底链、信号链、主导燃料链和保护燃料链；

所述基底链包括顺序连接的淬灭基团、准粘性末端和待测microRNA的互补序列；

所述信号链与基底链互补，所述信号链一端修饰有荧光基团；

所述保护燃料链与待测microRNA互补；