[发明专利]一种牦牛与黄牛肉源性鉴别的方法

说明书

本发明提供了一种利用HRM法进行牦牛与黄牛肉源性鉴别的方法，包括以下步骤：1)选取牦牛线粒体12S rRNA基因中和黄牛12S rRNA基因的差异位点，根据选取的差异位点，设计标记引物和标记探针；2)提取待测样品的全基因组DNA；3)以步骤2)中得到的待测样品全基因组DNA为模板，加入步骤1)中所述的标记引物和标记探针进行不对称PCR扩增得到PCR扩增产物；4)用HRM法检测步骤3)中得到的PCR扩增产物的熔解温度，绘制熔解曲线，若熔解峰在55～60℃温度范围内，则待测样品为牦牛肉，若熔解峰在65～70℃范围内，则待测样品为黄牛肉。

技术领域

本发明涉及肉类品质检测领域，尤其涉及一种牦牛与黄牛肉源性鉴别的方法。

背景技术

肉类掺假现已成为我国食品肉类质量安全控制面临的重要挑战之一。牦牛肉是高原特有的无污染绿色食品，因其营养价值较高，风味独特，相应价格与其它牛肉也存在较大差异，这使得市面上出现大量使用普通黄牛肉假冒牦牛肉及其制品的非法现象。

目前，对于肉制品源性成份的常规鉴别方法主要采用基于PCR的核酸水平的检测，包括DNA探针杂交、RFLP-PCR法(限制性片段长度多态性扩增)、RAPD-PCR法(随机扩增多态性PCR)等方法。但上述几种方法存在操作复杂，灵敏度低，重复性差等问题，是基于核酸水平进行肉制品源性成份快速准确鉴别的障碍。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种操作简单、灵敏度高、重复性好的牦牛与黄牛肉源性鉴别的方法。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种利用HRM法进行牦牛与黄牛肉源性鉴别的方法，包括以下步骤：

1)选取牦牛和黄牛线粒体12S rRNA基因中和黄牛12S rRNA基因的差异位点，根据选取的差异位点，设计标记引物和标记探针，所述标记引物包括上游引物和下游引物；

2)提取待测样品的全基因组DNA；

3)以步骤2)中得到的待测样品全基因组DNA为模板，加入步骤1)中所述的标记引物和标记探针进行不对称PCR扩增得到PCR扩增产物；

4)用HRM法检测步骤3)中得到的PCR扩增产物的熔解温度，绘制熔解曲线，若熔解峰在55～60℃温度范围内，则待测样品为牦牛肉，若熔解峰在65～70℃范围内，则待测样品为黄牛肉；

所述步骤1)和步骤2)之间无时间顺序限定。

优选的，所述差异位点的序列如SeqIDNo.1所示。

优选的，所述上游引物的序列如SeqIDNo.2所示，所述下游引物的序列如SeqIDNo.3所示。

优选的，所述标记探针的长度为19～35bp，Tm值介于59～61℃之间，所述标记探针3’末端用错配碱基封闭。

优选的，所述标记探针的序列如SeqIDNo.4所示。

优选的，所述标记探针的3'端糖环上C6被NH₂封闭，阻止PCR过程探针自身的扩增。

优选的，步骤3)中所述的不对称PCR扩增的反应体系包括以下组分：以12μL体系计量，上游引物1μL，下游引物0.2μL，探针1μL，待测样品基因组DNA2μL，2×TaqMix 5μL，ddH₂O1.8μL，LC Green 1μL。

优选的，所述的不对称PCR扩增的程序为：95℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，45个循环；75℃延伸5min，4℃反应终止。

优选的，步骤4)中HRM法检测溶解的过程为：将所述PCR扩增产物从35℃升温至96℃，每升温0.025℃收集一次荧光信号，反应完成后降温至35℃。