[发明专利]一种间充质干细胞无血清培养基及其配制方法和应用

说明书

本发明公开了一种间充质干细胞无血清培养基及其配制方法和应用。通过添加EGF、PDGF、bFGF、β‑TGF、BMP‑7及Wnt5a来替代血清中的细胞因子；添加亚油酸、亚麻酸、卵磷酸替代血清中的脂类物质；通过正交设计，对这些添加物进行复配，并获得良好的增殖效果。而且本发明成份明确，减少了批次间的差异；无潜在的外源性病毒和致病性因子的风险；减少了临床研究的不良反应。具有很好的应用前景。

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及到一种新型间充质干细胞无血清培养基的配方及配制方法，以及在人脐带间充质干细胞的原代培养及大规模传代培养中的应用。

背景技术

随着再生医学的迅猛发展，干细胞的研究及其临床应用已是当今生命科学最前沿最热门的领域之一，它不但为人类战胜多种疾病带来希望，而且具有巨大的市场潜力。而与干细胞研究及临床应用息息相关的培养基则是不可或缺的重要一环。目前，干细胞的培养都添加了一定量的动物源性的血清，如新生牛血清或胎牛血清，来满足干细胞生长增殖的需要。但也存在许多问题：(1)血清是种非常复杂的混合物，成分多样，目前对其准确的成分、含量及其作用机制仍不清楚，有些可能对干细胞的生长产生抑制或毒害作用；(2)血清都是批量生产，各批次之间生物活性物质及因子等成份或含量不一致，导致实验结果或产品的重现性较差，使得干细胞生产标准化困难；(3)动物血清可能存在外源性病毒和致病性因子的风险，如支原体、病毒等，导致干细胞生产污染；(4)大规模干细胞培养中，血清价格昂贵，是构成生产成本的主要部分之一；(5)干细胞的临床应用中，残留的血清可能会引起患者的过敏反应。

发明内容

本发明的目的是提供一种化学成分限定的间充质干细胞无血清培养基，这种无血清培养基是目前最安全的，最为理想的培养基。其优点如下：(1)成份明确，避免血清批次间的质量变动，提高干细胞研究及临床应用结果的可重复性；(2)避免血清对干细胞培养的毒性作用和血清源性污染；(3)降低了干细胞培养及临床应用的成本；(4)有利于干细胞体外培养的分化；(5)减少了干细胞临床应用可能引起的过敏反应，降低了风险。

本发明的间充质干细胞无血清培养基，是由9倍体积基础培养基与1倍体积的浓缩添加剂混合而成；

混合后基础培养基中各组分的终浓度如下：

DMEM-LG培养基粉末10g/L；Purmorphamine 1-20μM；胰岛素1.0-20.0mg/L；转铁蛋白0.5-10.0mg/L；乙醇胺0.2-2.0mg/L；L-抗坏血酸-2-磷酸5-50μmol/L；2-巯基乙醇0.5-5.0×10^-5mol/L；L-谷氨酰胺30-300mg/L；L-丙氨酰-L-谷氨酰胺20-200mg/L；亚硒酸钠1-10mg/L；丙酮酸钠20-200mg/L；硫酸亚铁0.5-5.0mg/L；氯化锌0.2-2.0mg/L；地塞米松0.5-5.0nmol/L；碳酸氢钠1000-3000mg/L；4-羟乙基哌嗪乙磺酸500-2000mg/L；

配制的浓缩添加剂组分及浓度(与基础培养基混合之前)：

人血清白蛋白10-50g/L；纤黏连蛋白2-20mg/L；α-抗胰蛋白酶1-20mg/L；亚油酸0.5-10mg/L；亚麻酸2-20mg/L；卵磷脂1-10mg/L；BMP-7 1-50μg/L；Wnt5a 50-200μg/L；EGF10-200μg/L；bFGF 20-200μg/L；PDGF 5-50μg/L；TGF-β 1-50μg/L。

本发明所述的间充质干细胞无血清培养基优选混合后基础培养基中各组分的终浓度如下：