[发明专利]一种植物线虫永久玻片的制作方法

说明书

技术领域

本发明涉及植物线虫标本制作技术领域，具体为一种植物线虫永久玻片的制作方法。

背景技术

植物线虫属于无脊椎动物中的线虫门，能寄生于植物根、茎、叶、果实、种子等部位，其种类繁多、危害严重。据不完全统计，全世界每年因植物线虫造成的农林作物经济损失在数千亿元以上。我国2007年公布的对外植物检疫性有害生物名录中，有20种(属)的线虫为检疫性线虫，其实际种数多达200种以上。

在植物线虫检测鉴定研究工作中，一般首先必须制作临时玻片，对线虫的形态结构进行初步观察和摄影，并对各种数据进行测计。随后，需进一步将样品制成永久玻片，作为实验室的实物标本，可作为检疫实验室的截获证据，也可供教学或科研需要，尤其对鉴定的新种，必须要求有模式标本。

一般线虫永久玻片制作过程较为复杂，制作步骤多，涉及标本的杀死、固定、脱水、制片等步骤。而且需耗时较长，一般需要5～6周。公开号为CN102640742A的中国专利公开了一种对传统的永久玻片制作方法改进的技术方案，但该方案仍需用2种脱水液，且用时需20天左右。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供简易的线虫永久玻片制作方法，其方法便捷、可操作性强、效果好。

具体的技术方案如下：

一种植物线虫永久玻片的制作方法，包括以下步骤：

a、将含有线虫的水溶液在55-60℃温浴2-3min后离心，分离水层得到线虫液，将所述线虫液在固定液中浸泡24h以上；

b、将含有线虫的固定液离心，分离上层固定液得到固定后的线虫，将固定后的线虫与1.5～2.5ml甘油水溶液混合置于24孔细胞培养皿中，再将所述24孔细胞培养皿在35℃～40℃条件下恒温放置40h～50h，得到完全脱水浸泡于甘油中的线虫；其中，所述甘油水溶液包括体积比为1:15～25的甘油与水；

c、在载玻片上滴加甘油，将所述完全脱水浸泡于甘油中的线虫移至载玻片的甘油滴中，在甘油滴两边放蜡块，加盖玻片，加热至蜡块融化后冷却。

本发明中，所述线虫固定液包括体积比为5～15:1～5:65～94的40wt％甲醛、甘油和水。

本发明步骤a或步骤b中，所述离心的转速独立地为2000～4000r/min，离心时间独立地为1～5min。

本发明步骤c中，移至甘油滴中央的线虫为已完全脱水的雌、雄线虫各若干条，排列均匀。

步骤c中，所述加热步骤具体为，将含有蜡块的玻片置于50～70℃的加热板上加热，所述加热的时间为20～40s。

步骤c中，玻片冷却后，在所述玻片上贴上标签，所述标签上包括样品号、寄主、产地、制作日期。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

本发明简化了永久玻片制作的复杂程序，在脱水过程中只需要使用一种脱水液，其操作过程和所需材料比常规线虫永久玻片制片方法简化了许多，降低了制作难度。本发明植物线虫永久玻片简易制作方法，从杀死、固定、脱水和制片的全过程仅需约3d，操作简单、快捷，对各种常见植物线虫都能获得较好的永久玻片。

具体实施方式

下面将结合本发明中的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

一种植物线虫永久玻片的制作方法，包括以下步骤：

线虫的杀死与固定：将含有线虫的水溶液温浴后离心，分离水层得到微量线虫液，在线虫液中加入固定液浸泡，杀死和固定线虫。

本发明中目标线虫需是活的，最好是刚从土壤或植物组织中分离出的，若分离出的目标线虫放置过久而没有固定或固定时间短，会使线虫变形。将含有线虫的水溶液温浴以杀死线虫。温浴温度优选为55-60℃，进一步为56-58℃，温浴时间优选为2-3min。将温浴后的含有线虫的水溶液离心，使线虫和水分离。所述离心的转速为2000～4000r/min，优选为2500～3500r/min，进一步为3000r/min；离心时间为1～5min，优选为2～4min，更优选为3min。