[发明专利]基于G-四链体-血红素复合物和聚合链式放大反应检测单链目标DNA浓度的电化学方法

说明书

基于G‑四链体‑血红素复合物和聚合链式放大反应检测单链目标DNA浓度的电化学方法，属于分析化学技术领域。本发明设计了捕获探针和辅助探针，辅助探针两端均含能与目标DNA互补的核酸序列，而中间含有能形成G‑四链体的碱基序列。捕获探针与目标DNA相互识别，发生连续的聚合链式反应，形成链状聚集体，并被金电极表面的捕获探针固定至电极，在电极表面引入大量G‑四链体结构。随后G‑四链体与血红素结合形成具有很强电化学信号的复合物，通过差分脉冲伏安法（DPV）扫描得到的电化学信号与电极表面的G‑四链体‑血红素复合物，以及体系中加入的目标DNA浓度存在对应关系，实现对目标DNA的检测。用该方法对样品中的HIV DNA进行检测，取得了理想的效果。本发明方法具有灵敏度高、特异性强的优点。

技术领域

本发明涉及一种基于G-四链体-血红素复合物和聚合链式放大反应检测单链目标DNA浓度的电化学方法，属于分析化学技术领域。

背景技术

对特定的基因序列进行检测在临床诊断、疾病的预防和治疗、环境检测、食品安全检测等方面有十分重要的意义。传统的DNA检测方法存在一定的缺点，如操作繁琐、可能导致放射性污染、需要昂贵的检测仪器、灵敏度不高等。电化学DNA生物传感技术与传统的基因检测技术相比，具有操作简单、响应速度快、灵敏度高、环境友好、可便携性好、不污染破坏检测样品等优势。上述的这些优势使得电化学DNA生物传感技术逐渐成为DNA序列检测方面的热门技术方法。

研究新型电化学DNA生物传感器，开发出灵敏度高、特异性强、检测限低的特定基因序列的检测方法在医学检测、食品工业、环境监测等诸多领域具有重要意义和广泛的应用前景。

发明内容

本发明的目的是将DNA杂交技术，信号放大技术与生物传感技术相结合，用G-四链体-血红素复合物作为信号标记，通过聚合链式进行信号放大，建立了一种灵敏度高、特异性强的针对单链目标DNA的检测方法。

本发明的技术方案，一种基于G-四链体-血红素复合物和聚合链式放大反应检测单链目标DNA浓度的电化学方法，其设计了两个特殊的DNA序列：捕获探针和辅助探针。特殊设计的辅助探针两端均含有能与目标DNA互补配对的核酸序列，而中间含有能形成G-四链体的碱基序列。将捕获探针固定到金电极表面。当体系中加入目标DNA时，捕获探针与目标DNA相互识别，由于辅助探针5’端序列能和目标DNA的 5’端序列反向互补，3’端序列能与目标DNA的3’端序列反向互补，中间部分能够折叠形成G-四链体，因而目标DNA 能与辅助探针发生按1:1的分子比发生连续的聚合链式反应，从而在电极表面引入大量G-四链体结构。在有血红素存在时，G-四链体与血红素结合形成具有很强电化学信号的复合物从而提供检测信号。测得的电化学信号与目标DNA浓度存在对应关系，从而实现对目标DNA的定量灵敏检测。该方法在实际样品中也能对目标DNA进行了灵敏检测。具体原理如图1。

首先将捕获探针固定到金电极上；将不同浓度的目标DNA、辅助探针和固定在电极表面的捕获探针混合杂交作用，包括：目标DNA的一部分序列和捕获探针发生杂交反应形成双链，另一部分序列与辅助探针发生杂交形成双链；由于辅助探针两端均含有能与目标DNA两端互补配对的核酸序列，通过目标DNA与辅助探针发生连续的聚合链式反应，借助辅助探针中间的G-四链体形成序列，在电极上引入大量的G-四链体结构；在血红素存在时形成G-四链体-血红素复合物；电化学法检测响应电流值。

捕获探针序列与目标DNA的3’端反向互补，并且5’端带有巯基用于固定至金电极。辅助探针由三部分组成：5’端序列能和目标DNA的 5’端序列反向互补，3’端序列能与目标DNA的3’端序列反向互补，中间部分能够折叠形成G-四链体。

具体步骤如下：