[发明专利]基于G-四链体-血红素复合物和聚合链式放大反应检测单链目标DNA浓度的电化学方法

权利要求书

1.一种基于G-四链体-血红素复合物和聚合链式放大反应检测单链目标DNA浓度的电化学方法，其将捕获探针固定到金电极上，然后将不同浓度的目标DNA、辅助探针和固定在电极表面的捕获探针混合杂交，电化学法检测响应电流值；具体步骤如下：

（1）金电极的预处理：将金电极在氧化铝粉末上打磨；后依次在超纯水、无水乙醇、超纯水中40KHz超声清洗2-3 min；清洗结束后将金电极插入到0.5M H₂SO₄溶液中循环伏安法扫描活化，扫描范围从-0.4V至+1.5V，扫描速度100mV/s，直到获得稳定的CV图为止；将处理后的金电极用超纯水冲洗并用氮气吹干；

（2）捕获探针的固定：将合成好的捕获探针用10mM PBS缓冲液溶解，-20℃冰箱中保藏；将捕获探针用PBS缓冲液稀释；将100μL、0.3μM的捕获探针溶液倒扣到步骤（1）处理所得金电极上，使得捕获探针在金电极表面上形成自组装单分子层；用2mM巯基己醇封闭金电极4h，得到修饰有捕获探针的金电极；用超纯水淋洗电极，氮气吹干待用；

（3）捕获探针、目标DNA以及辅助探针之间的杂交：将步骤（2）所得修饰有捕获探针的金电极浸没到100 μL的反应体系中，室温反应2h；所述反应体系为：0.8μM辅助探针、一定浓度的目标DNA、双蒸水及20mM PBS缓冲液；

（4）G-四链体-血红素复合物的形成：将200μL的G-四链体形成液倒扣在电极上，室温下放置30min；向G-四链体形成液中加入2μL 20mM血红素混匀；将反应液继续倒扣到电极上，室温下放置1h；用超纯水冲洗电极，用于电化学检测；

（5）电化学检测：

a、电化学反应：采用三电极系统，步骤（4）所得金电极作为工作电极，Ag/AgCl作为参比电极，铂丝作为对电极；工作溶液为含pH 7.4、20 mM KCl的20 mM HEPES缓冲液，检测前先通入氮气30 min；

b、标准曲线的绘制：检测方法为差分脉冲伏安法DPV，扫描范围-0.6～-0.15 V，振幅50mV；取一系列不同浓度的目标DNA，以步骤（1）-（4）同样操作后对其进行检测，绘制峰电流和目标DNA浓度的关系曲线；

c、检测：对于未知浓度目标DNA样品，按上述步骤（1）-（4）同样操作后对其进行检测，测得峰电流后从标准曲线可读出其浓度值；

其特征在于：所述辅助探针两端均含有能与目标DNA互补配对的核酸序列，而中间含有能形成G-四链体的碱基序列，具体为

5’-目标序列后11个碱基的互补序列+ TTTGGGTAGG GCGGGTTGGG CT+目标序列前11个碱基的互补序列-3’；

所述捕获探针具体为5’-HS-（CH₂）₆-TT+目标序列前11个碱基的互补序列-3’。

2.根据权利要求1所述基于G-四链体-血红素复合物和聚合链式放大反应检测单链目标DNA浓度的电化学方法，其特征在于：所述PBS缓冲液中含有1mM Mg²⁺、1M NaCl，其pH为7.4。

3.根据权利要求1所述基于G-四链体-血红素复合物和聚合链式放大反应检测单链目标DNA浓度的电化学方法，其特征在于：所述G-四链体形成液为每10 mM HEPES缓冲液中含有50mM KCl，其pH为8.0。

4.权利要求1所述基于G-四链体-血红素复合物和聚合链式放大反应检测单链目标DNA浓度的电化学方法的应用，其特征在于：对HIV DNA样品的浓度进行了检测，以HIV基因片段作为目标DNA，其序列为：

5’- GGCAGCAATT TCACCAGTAC TA -3’ ；

相应的，设计其捕获探针序列为：5’- HS-(CH₂)₆-TTTAGTACTG GTG -3’；

设计辅助探针序列为：

5’-AAATTGCTGC CTTTGGGTAG GGCGGGTTGG GCTTAGTACT GGTG -3’；其中斜体部分表示可以形成G-四链体的碱基。