[发明专利]一种诱导性多能干细胞的制备方法

说明书

本发明公开了一种诱导性多能干细胞的制备方法，该方法构建了含有小鼠Oct4、Sox2、Klf4和c‑Myc四种基因的慢病毒及其激活慢病毒，并使用这两种慢病毒感染人外周血单核细胞来获得诱导性多能干细胞(iPSCs)，具体包括下列步骤：(1)人外周血单核细胞的分离与培养；(2)质粒的构建和扩增；(3)慢病毒的构建；(4)慢病毒感染人外周血单核细胞以及iPSCs的获得。本发明将小鼠Oct4、Sox2、Klf4和c‑Myc四种转录因子整合到一个质粒上，进而构建了同时含有这四种基因的慢病毒及其激活慢病毒，利用这两种病毒可使得人外周血单核细胞成为iPSCs。与使用多个含有单个基因病毒的常规iPSCs制备方法相比，本方法减少了所需要病毒的数量，大大简化了慢病毒的制备步骤，并降低了污染的风险。

技术领域

本技术涉及一种诱导性多能干细胞的制备方法，特别涉及一种利用同时具有四种基因的慢病毒及其激活病毒进行细胞转染以制备诱导性多能干细胞的方法。

背景技术

诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)是2006年日本科学家山中伸弥首次利用逆转录病毒载体将Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc四个转录因子导入小鼠皮肤成纤维细胞中，使其重编程所获得的一种多能性干细胞。iPSCs在形态、基因及蛋白表达、表观遗传修饰状态、细胞倍增能力、类胚体和畸形瘤生成能力、分化能力等均与胚胎干细胞极为相似。2007年山中伸弥和美国汤普森实验室都报道，利用几种特定的转录因子可以诱导人皮肤成纤维细胞成为iPSCs。两个实验室采用了不同的诱导方案，山中伸弥实验室使用逆转录病毒引入Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4四种因子组合，而汤普森实验室使用慢病毒载体引入Oct4、Sox2加Nanog和LIN28这种因子组合。逆转录病毒只能转导分裂期细胞，而慢病毒载体可以感染非分裂期细胞，容纳外源性目的基因片断大、免疫反应小等特点，因而应用广泛。十年来，尽管新型转染载体不断出现，如腺病毒、脂质体、小分子等，然而慢病毒转染的效率仍然是最高的，大量的基础研究和应用技术研发依然是基于慢病毒转染方法。

由于制备iPSCs需要使用多种因子的组合，常规的感染方法是，首先分别构建含有单一基因的质粒，之后分别包装成含有单一基因的慢病毒，接下来将各个含有单一基因的慢病毒进行混合，最后使用混合病毒液感染目的细胞。这种常规慢病毒感染方法需要制备多个含有单一基因的慢病毒，步骤繁琐，耗时长，且多次重复操作造成污染几率增加。

针对上述常规慢病毒制备iPSCs方法所存在的关键问题，迫切需要进一步优化iPSCs制备技术。本发明开发了一种新的制备诱导性多能干细胞的方法，即构建同时含有四种基因的慢病毒及其激活病毒，使用这两种病毒来感染人外周血单核细胞，从而得到iPSCs。此新方法减少了所需病毒的数量，大大简化了慢病毒的制备过程，进一步提高了iPSCs制备过程的效率，大大降低了污染的风险。

发明内容

本发明的目的在于提供一种诱导性多能干细胞的制备方法。

为实现上述目的，本发明所采用的技术方案包括下列步骤：

(1)人外周血单核细胞的分离与培养

利用Ficoll淋巴细胞分离液分离人外周血单核细胞，使用含有生长因子的外周血单核细胞培养液培养4-7天；

(2)质粒的构建和扩增

构建Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ号四种质粒，将所构建好的质粒分别取上清液做转化，用5-alpha大肠杆菌感受态或NEB感受态或C2987H感受态进行转化，均使用氨苄青霉素抗性的固体培养基；次日挑取克隆置于氨苄青霉素的液体培养基中扩增，用质粒提取试剂盒提取质粒；

所述Ⅰ号质粒为psPAX2s质粒，此质粒是第二代慢病毒包装质粒，在原核生物中具有氨苄青霉素抗性；

所述Ⅱ号质粒为pMD2.G质粒，此质粒是水泡性口炎病毒包膜质粒，在原核生物中具有氨苄青霉素抗性；