[发明专利]一种水蛭提取物及其制备方法与应用

说明书

本发明公开了一种水蛭提取物的制备方法：将水蛭加水匀浆后，经可控酶解、有机溶剂沉淀、超滤、阴离子交换层析制得水蛭提取物。该水蛭提取物可用于制备具有抗凝作用、溶栓作用、抑制血小板聚集作用及神经保护作用的药物。本发明从中药现代化的技术要求出发，采用可控酶解技术提取水蛭中的肽类成分，结合生物制药技术，采用超滤、凝胶层析的分离技术进一步进行纯化，得到了比传统水蛭提取物纯度更高、活性更强的提取物。该方法突破了传统动物药在提取、分离方面的瓶颈，解决了传统动物药以原粉应用时用量大、味道腥臭的问题。

技术领域

本发明涉及一种水蛭提取物及其制备方法与应用

技术背景

水蛭功效为破血、逐瘀、消癥。可用于癥瘕痞块，血瘀经闭，跌打损伤，血小板增多症，及脑出血。水蛭始载于《神农本草经》：“主逐恶血，瘀血，月闭，破血瘕积聚，无子，利水道。”《本草纲目》：“咸走血，苦胜血。水蛭之咸苦，以除蓄血，乃肝经血分药，故能通肝经聚血。”

水蛭作为传统中药，临床应用很广泛，但是有效成分并不明确，文献报道其中的蛋白质、多肽等为主要有效成分。有效成分不明确是动物类药材的固有的问题，采用传统的提取、浓缩工艺方法，使有些成分分解、破坏，或提取不出来，易使有效成分损失，不适宜动物类药材。

发明内容

本发明提供了一种采用可控酶解法制备的水蛭提取物及其制备方法，以提高水蛭提取物的质量可控性及生理活性。本发明还提供了水蛭提取物的应用。发明是通过以下技术方案实现的：

一种水蛭提取物的制备方法，步骤如下：

(1)取水蛭干燥全体粉碎成30～120目粉末，加入8～15倍量的水，或取水蛭鲜活全体，加入1～5倍量的水，匀浆；

(2)取匀浆液，调整pH至7～9，按每1g底物加入2000～20000U酶的比例加入胰蛋白酶或/和胰酶，控制温度30℃～60℃，酶解2～12小时，冷却至室温；

(3)向上述酶解液中加入1～5倍体积的乙醇或/和丙酮冷藏沉淀1～2次，过滤，取滤液减压回收，残渣加水溶解，微孔滤膜过滤；

(4)将上述滤液通过分子截留量为5000Da的超滤膜，收集分子量小于5000Da的部分；

(5)将上述超滤液的pH调整至7.5～9.5，通过阴离子交换树脂，先用水或pH7～9、0.01～0.05mol/L的Tris-盐酸缓冲液或pH7～9、0.01～0.05mol/L的二乙醇胺-盐酸缓冲液冲洗，将冲洗液弃去，然后以0.1～2mol/L的氯化钠溶液洗脱，收集洗脱液，脱盐，浓缩，喷雾干燥或冷冻干燥即得到水蛭提取物。

所述步骤(1)中，水蛭干燥全体粉碎成80～100目粉末，加入9～13倍量的水；或用水蛭鲜活全体，加入2～4倍量的水。

所述步骤(2)中，调整pH为8～9，按每1g底物加入5000～10000U蛋白酶的比例加入胰蛋白酶或/和胰酶(当同时加入胰蛋白酶和胰酶时，两者之间没有比例的限定)，控制温度45℃～55℃，酶解4～10小时，冷却至室温。

所述步骤(3)中，向酶解液中加入2～4倍体积的乙醇或/和丙酮冷藏沉淀1～2次，过滤，取滤液60℃以下减压回收溶媒，残渣加水溶解，微孔滤膜过滤。

所述步骤(5)中，阴离子交换树脂是以纤维素为基质的阴离子交换树脂、以葡聚糖为基质的阴离子交换树脂或以琼脂糖为基质的阴离子交换树脂中的任一种；所述用于洗脱的氯化钠溶液为0.1～2mol/L的氯化钠水溶液或含0.1～2mol/L氯化钠的pH7～9、0.01～0.05mol/L的Tris-盐酸缓冲液或含0.1～2mol/L氯化钠的pH7～9、0.01～0.05mol/L三乙醇胺-盐酸缓冲液；所述脱盐采用钠滤法或葡聚糖凝胶法。