[发明专利]一种富集分离糖肽的方法

说明书

本发明涉及材料分析化学和翻译后修饰蛋白组学等领域。本发明提供一种富集分离糖肽的方法，该方法是将响应性聚合物糖肽富集与蛋白酶解物接触，采用柱固相萃取模式或分散固相萃取模式分离富集糖肽，并对样品进行质谱分析，所述响应性聚合物响应性聚合物糖肽富集材料是利用表面引发‑原子转移自由基聚合反应机制，将异丙基丙烯酰胺和硫脲衍生物在基底材料表面经过共聚所得，所述基底材料的粒径是0.2‑50μm,孔径为该方法通过对富集过程pH，温度，有机相浓度等条件的控制，实现了复杂混合物(高非糖肽掺入比)中糖肽高选择性、高重复性和高通量富集，显著提高了糖蛋白中糖基化位点的鉴定数目。

技术领域

本发明涉及材料分析化学和有机化学领域，尤其涉及一种富集分离糖肽的方法。

背景技术

可逆的蛋白质糖基化在细胞生命活动中具有重要的调控作用，因此在分子水平研究蛋白质糖基化对揭示其在生命过程的调节机制意义重大。以质谱为基础的蛋白组学方法是鉴定蛋白糖基化的常规方法。但是在质谱分析前，需要对低丰度的糖肽/糖蛋白进行选择性的富集，以提高糖肽在质谱中信号强度和鉴定数目。已有的糖肽富集方法主要有凝集素法、肼化学法、硼酸法以及亲水作用色谱法等。但是这些方法都存在一定的局限性：凝集素亲和作用色谱存在糖基化覆盖率低的问题[Kubota,et al.Anal.Chem.2008]；肼化学对糖肽的选择性高，但是在洗脱过程中破坏糖链[Zhang,H.；et al.Nat.Biotechnol.2003.]；硼酸化学法和亲水作用色谱法在抓取糖肽时存在一定的非特异性吸附，选择性有待提高。因此，为了实现复杂生物样品中大规模富集糖肽的目的，亟需一种简单高效，在保证糖肽覆盖率的同时又能有效排除非糖肽干扰的新型富集方法。

发明内容

本发明为解决上述技术问题提供一种具有高选择性、高吸附量、操作简单和重复性好的富集分离糖肽的方法，能对低化学计量的糖肽进行选择性富集和分离。

本发明的技术方案如下：

一种富集分离糖肽的方法，该方法是将响应性聚合物糖肽富集材料与蛋白酶解物接触，采用柱固相萃取模式或分散固相萃取模式分离富集糖肽，并对样品进行质谱分析，所述响应性聚合物糖肽富集材料为：

其中x＝0.1～0.9(x和1－x用于代表其下方对应单体数量之间的相互关系，/代表单体间顺序连接聚合)；n＝10²～10⁶；R为氨基酸、单糖、二糖、二肽、氨基酸数为2～4的寡肽和两性离子化合物。所述响应性聚合物糖肽富集材料是利用表面引发-原子转移自由基聚合反应机制，将异丙基丙烯酰胺和硫脲衍生物在基底材料(Matrix)表面经过共聚所得；所述基底材料为Si、Cu、Ag、Au、Pt、CuO、Fe₃O₄、多孔SiO₂、多孔Al₂O₃、多孔TiO₂或多孔ZrO₂中的任意一种或者两种以上任意比例的混合；所述基底材料的粒径是0.2-50μm,孔径为

上述方案中，采用柱固相萃取模式(SPE)，具体步骤如下：

1)在SPE模式下，首先将响应性聚合物材料加载到末端带有筛板的移液枪枪头或者SPE小柱上，采用洗脱液冲洗材料，之后用上样液平衡材料，然后将溶解在上样液中的样品加载到材料上，之后采用淋洗液冲洗材料除去非糖肽，最后用洗脱液洗脱材料上的糖肽；在dSPE下，将富集材料放在离心管中，采用洗脱液冲洗材料，然后用上样液平衡材料，之后把材料与溶解在上样液中的样品混合，孵化时间10-120分钟，离心弃上清液，沉淀部分用冲洗液冲洗需要振荡3-10分钟，离心取上清液，浓缩即为非糖肽，沉淀部分用洗脱液洗脱糖肽需要震荡5-30分钟，浓缩即为糖肽。

2)上样液组成为缓冲盐溶液或酸水溶液与有机溶剂的混合液，有机溶剂的比例为70-85％，pH在1-5范围内，缓冲盐的浓度为0-50mM，酸水溶液中酸的浓度为0.1％-5％