[发明专利]一种富集分离糖肽的方法

权利要求书

1.一种富集分离糖肽的方法，其特征在于，是将响应性聚合物糖肽富集材料与蛋白酶解物接触，采用柱固相萃取模式或分散固相萃取模式分离富集糖肽，所述响应性聚合物糖肽富集材料为：

其中x=0.1~0.9；n=10²~10⁶；R为羧基、氨基酸、单糖、二糖、氨基酸数为2~4的寡肽；Matrix为基底材料，所述基底材料为Si、Cu、Ag、Au、Pt、CuO、Fe₃O₄、多孔SiO₂、多孔Al₂O₃、多孔TiO₂或多孔ZrO₂中的任意一种或者两种以上任意比例的混合。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：

所述响应性聚合物糖肽富集材料是利用表面引发-原子转移自由基聚合反应机制，将异丙基丙烯酰胺和硫脲衍生物在基底材料（Matrix）表面经过共聚所得；所述基底材料的粒径是0.2-50 μm, 孔径为5-1000 Å。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：将所述响应性聚合物糖肽富集材料作为富集材料，采用柱固相萃取模式（SPE）和分散固相萃取模式（dSPE）富集和纯化糖肽；

在SPE模式下，首先将响应性聚合物材料加载到末端带有筛板的移液枪枪头或者SPE小柱上，采用洗脱液冲洗材料，之后用上样液平衡材料，然后将溶解在上样液中的样品加载到富集材料上，之后采用淋洗液冲洗材料除去非糖肽，最后用洗脱液洗脱材料上的糖肽；

在dSPE下，将富集材料置于离心管中，采用洗脱液冲洗材料，然后用上样液平衡材料，之后把材料与溶解在上样液中的样品混合，孵化后，离心弃上清液，所剩沉淀部分用冲洗液冲洗，震荡后，离心取上清液，浓缩即为非糖肽，沉淀部分用洗脱液洗脱糖肽，震荡后，离心取上清液即得糖肽。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：

上样液组成为缓冲盐与有机溶剂的混合液或酸水溶液与有机溶剂的混合液，有机溶剂的体积比例为70-85%，上样液整体的pH在1-5范围内，缓冲盐的浓度为0-50 mM，酸水溶液中酸的质量浓度为0.1%-5%；

淋洗液组成为缓冲盐溶液与有机溶剂的混合液或酸水溶液与有机溶剂的混合液，有机溶液的体积比例为55-80%，淋洗液的pH=1-5，缓冲盐的浓度为0-50 mM，酸水溶液中酸的质量浓度为0.1%-5%；

洗脱液组成为缓冲盐溶液与有机溶剂的混合液，有机溶剂的体积比例为0-50%，洗脱液的pH值在0-3或10-14范围内，缓冲盐的浓度为0-500 mM。

5.按照权利要求3所述方法，其特征在于，所用的蛋白酶解液应旋干去盐，重溶于上样液，样品的上样量与响应性聚合物材料量之间的体积比例为1:20-1:1000，实验操作温度为15-50摄氏度。

6.按照权利要求4所述方法，其特征在于，冲洗材料所用洗脱液的体积为材料体积的3-50倍，平衡材料所用的上样液体积材料体积的3-50倍，上样体积为材料体积的5-200倍，淋洗材料所用的淋洗液体积为材料体积的5-100倍，洗脱糖肽所用的洗脱液体积为材料体积的5-10倍。

7.按照权利要求3所述方法，其特征在于，采用dSPE方法富集糖肽，振荡转数为100-2500rpm，样品与材料之间的孵化时间10-120分钟，孵化温度为15-50度。

8.按照权利要求4所述方法，其特征在于，有机溶剂包括但不局限于乙腈、甲醇、乙醇中的一种或两种以上，缓冲盐包括但不局限于甲酸铵，乙酸铵或碳酸氢铵，酸包括但不局限于甲酸、乙酸、三氟乙酸中的一种或两种以上。