[发明专利]猪流行性腹泻病毒灭活疫苗及其制备方法

说明书

一种猪流行性腹泻病毒灭活疫苗，含有灭活的猪流行性腹泻病毒和佐剂，其中佐剂是由以重量百分含量计5%角鲨烷、1%油酸、1%吐温80、92%0.005M柠檬酸钠缓冲溶液和1%的β‑葡聚糖组成，所述猪流行性腹泻病毒是由猪流行性腹泻病毒毒株PEDV‑KB2013‑4株经灭活制备得到，其微生物保藏编号为CGMCC No.12663；分类命名：猪流行性腹泻病毒(Porcine Epidemic Diarrhea Virus，PEDV)；保藏时间是2016年08月23日；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体属于兽用生物制药领域，涉及猪流行性腹泻病毒灭活疫苗及其制备方法。

背景技术

猪流行性腹泻（Porcine Epidemic Diarrhea，PED）是由猪流行性腹泻病毒（Porcine Epidemic Diarrhea Virus，PEDV）引起一种急性、接触性病毒性肠道传染病，其病症以呕吐、水样腹泻、食欲下降和脱水为主，是常见的猪肠道传染性疾病。猪流行性腹泻病毒（PEDV）系冠状病毒科冠状病毒属成员，猪流行性腹泻病毒（PEDV）经口鼻感染后直接进入小肠，在小肠上皮细胞增殖，引起小肠绒毛吸收上皮细胞病变、损伤、脱落和小肠绒毛萎缩，导致肠内酶活性降低，吸收功能障碍，肠道内渗透压增高，引发渗透性腹泻，最终造成掉膘、降低饲料吸收利用率。PEDV严重影响了我国的养猪业，其感染性强、危害性大，是影响全球养猪业的最重要病毒之一，哺乳仔猪感染后死亡率可达100％，母猪常以带毒而不表现症状形式出现。近几年我国多省爆发PED，给养猪业造成了严重的经济损失。

目前尚无治疗猪流行性腹泻的特效药物，常规治疗效果不佳，因此仍以疫苗预防为主，而病毒株及其培养的成功与否是疫苗研制的关键因素。目前，国外使用的疫苗主要为韩国弱毒株，国内主要是哈尔滨兽医研究所研制的猪流行性腹泻、猪传染性胃肠炎二联灭活苗等，此疫苗中使用的毒株为猪流行性腹泻病毒PEDV CV777株，该毒株分离年代较早，通过对现流行毒株的基因分析，发现流行毒株与二十世纪70年代分离到的CV777 毒力基因发生了较大的改变，所以这也许是用含有原始毒株的疫苗免疫失败的原因之一。因此筛选新毒株，制备行猪流行腹泻疫苗用于预防猪流行性腹泻是十分必要的。

发明内容

为解决上述问题，本发明旨在提供一种猪流行性腹泻病毒灭活疫苗及其制备方法，其采用本公司分离保藏的猪流行性腹泻病毒毒株(PEDV-KB2013-4株)，其微生物保藏编号为CGMCC No.12663作为病毒毒株，该毒株遗传稳定，免疫原性能好，用其制备的灭活疫苗对于猪流行性腹泻具有良好的保护效力。

为解决以上技术问题，达成本发明的目的，本发明采用如下技术方案：

一种猪流行性腹泻病毒灭活疫苗，含有灭活的猪流行性腹泻病毒和佐剂，其中佐剂是由以重量百分含量计5%角鲨烷、1%油酸、1%吐温80、92% 0.005M柠檬酸钠缓冲溶液和1%的β-葡聚糖组成，所述猪流行性腹泻病毒是由猪流行性腹泻病毒毒株(PEDV-KB2013-4株)经灭活制备得到，其微生物保藏编号为CGMCC No.12663；分类命名：猪流行性腹泻病毒(Porcine Epidemic Diarrhea Virus，PEDV)；保藏时间是2016年08月23日；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

本发明还请求保护猪流行性腹泻病毒灭活疫苗在制备治疗猪流行性腹泻病毒感染药物中的应用。

本发明还提供所述猪流行性腹泻病毒灭活疫苗的制备方法，包括如下步骤：

a. 按照常规方法制备Vero细胞（Vero细胞购自美国ATCC），生长液为含10%新生牛血清的DMEM，培养至细胞长成单层时接种PEDV-KB2013-4病毒；