[发明专利]猪流行性腹泻病毒灭活疫苗及其制备方法

权利要求书

1.一种猪流行性腹泻病毒灭活疫苗，含有灭活的猪流行性腹泻病毒和佐剂，其中佐剂是由以重量百分含量计5%角鲨烷、1%油酸、1%吐温80、92% 0.005M柠檬酸钠缓冲溶液和1%的β-葡聚糖组成，所述猪流行性腹泻病毒是由猪流行性腹泻病毒毒株 PEDV-KB2013-4株经灭活制备得到，其微生物保藏编号为CGMCC No.12663；分类命名：猪流行性腹泻病毒(PorcineEpidemic Diarrhea Virus，PEDV)；保藏时间是2016年08月23日；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

2.根据权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒灭活疫苗在制备治疗猪流行性腹泻病毒感染药物中的应用。

3.根据权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒灭活疫苗的制备方法，包括如下步骤：

a. 按照常规方法制备Vero细胞，生长液为含10%新生牛血清的DMEM，培养至细胞长成单层时接种PEDV-KB2013-4病毒；

b. 取PEDV-KB2013-4毒株 5×10⁵TCID₅₀/ml 按1%接种长势良好的Vero单层细胞，置37℃吸附1小时，弃去吸附液，补加含有10 μg/mL胰蛋白酶的 DMEM作为维持液继续培养；

c. 接毒后，每日观察2次，记录细胞病变情况，细胞病变达80%以上时收获病毒，将收获的病毒在-80℃，反复冻融三次，6000 rpm离心20 min，收集上清液，即为病毒液；

d. 病毒液经20倍浓缩后，加入0.2%甲醛37℃灭活24小时得到PEDV-KB2013-4疫苗原液；

e. 配制佐剂，所述佐剂的配方含5%角鲨烷、1%油酸、1%吐温80、92% 0.005M柠檬酸钠缓冲溶液和1%的β-葡聚糖，其配制方法为：将处方量的吐温80、β-葡聚糖与柠檬酸钠缓冲液搅拌混匀，再加入处方量的油酸、角鲨烷，高压均质机1200bar，进行5个循环，然后收集料液，0.22 μm PTFE膜过滤除菌；

f. 将步骤d制得的PEDV-KB2013-4株疫苗原液和佐剂按1.5:1的体积比，无菌环境中，搅拌混合均匀，即制得猪流行性腹泻灭活疫苗。