[发明专利]重组牛胰蛋白酶突变体及其制备方法

说明书

本发明涉及生物技术领域，提供了一种重组牛胰蛋白酶突变体的制备方法以及所用的重组牛胰蛋白酶突变体。本发明是在大肠杆菌系统中表达重组牛胰蛋白酶突变体，表达量高，进一步提供了冷诱导表达载体和无需经过变性和复性的可溶性表达方法，并且纯化步骤简单方便；本发明的特点是重组牛胰蛋白酶突变体活性高、特异性强，且制备工艺简单、成本低。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种重组牛胰蛋白酶突变体及其制备方法。

背景技术

胰蛋白酶( Trypsin，EC 3. 4. 21. 4) 是一种以丝氨酸为活性中心的蛋白水解酶，拥有丝氨酸蛋白酶的一些典型特征：具有高度催化活性的三联体氨基酸( His-40，Asp-84，Ser-177)；稳定催化中间产物的氧离子孔 ( Gly-175，Ser-177＆Ser-192)； 底 物 特异 性 结 合 口 袋( Asp-171、Gly-194＆Gly-204)； 12 个 半 胱 氨 酸 残 基 构 成的 6 对 二硫键。在胰脏中，其以胰蛋白酶原的前体形式被合成和分泌。胰蛋白酶原在肠激酶或有活性的胰蛋白酶的催化下分解成为有活性的胰蛋白酶。不同物种的胰蛋白酶分子大小有一定差异，牛胰蛋白酶有223个氨基酸残基组成，分子量为23.3kDa，等电点为10.1-10.5.

胰蛋白酶水解多肽链中赖氨酸和精氨酸羧基端形成的肽键，在基因工程胰岛素的生产过程中，胰蛋白酶能将胰岛素原转化为有活性的胰岛素。但是由于胰蛋白酶对底物( Arg、Lys) 的切割选择性不强，在胰岛素的生产中就会产生副产物。而提高胰蛋白酶对 Arg 的切割选择性，降低对 Lys的切割选择性可以减少副产物的产生。Sichler 等分析人胰蛋白酶特异性结合口袋时发现：位于口袋底部的 Asp171可与 Arg 的侧链胍基形成强的离子键，与侧链较短的 Lys 只能以水桥的形式相互作用；口袋中的 Ser172 能够与 Arg 或Lys 形成氢键，加固底物与特异性结合口袋的结合。由于水桥作用力弱，Lys 与Asp171 的结合不牢固，Ser172 与 Lys 形成的氢键对于酶与底物 Lys 残基的稳定性结合起至关重要的作用。改变Ser172为其他氨基酸，或许可以降低对 Lys的切割选择性。

目前制备胰蛋白酶的方法主要有两类：一是从猪、牛等的胰脏中提取，因其方法相对简单，被广泛采用，但是该方法因不能完全除去其他蛋白质酶，且产品中的动物源病毒如口蹄疫病毒、疯牛病病毒等不能完全除去，因此其应用存在一定的局限性及风险性；另一种是采用基因重组的方法制备。目前基因重组的方法大多数是在大肠杆菌中通过基因重组的方法制备人源、猪或牛源胰蛋白酶，该方法先经表达得到不具活性的胰蛋白酶原包涵体，然后使胰蛋白酶原包涵体经过变性、复性过程，再经过酶切切去酶原的前体部分才能得到有活性的酶。而在所述变性、复性过程中，复性率不可能达到100%，因此该方法费时费力，产率不高。专利201410440706.X公开了一种应用毕赤酵母分泌表达牛胰蛋白酶的方法，该方法避免了形成包涵体，省去变性和复性过程，可直接从培养基中获得酶原，通过肠激酶酶切，再经纯化等步骤得到了高活力的牛胰蛋白酶，但由于牛胰蛋白酶原分子量较大，分泌量有限，故最终获得酶含量较低。专利201310043541.8公开了一种应用大肠杆菌可溶性表达牛胰蛋白酶的方法，该方法避免了形成包涵体，解决了因分子量大而难分泌表达的难题，但是该可溶性表达的牛胰蛋白酶因对大肠杆菌毒性较大而表达量较低。

本领域需要提供一种牛胰蛋白酶突变体来加强对Arg 的切割选择性，降低对 Lys的切割选择性，同时需要一种提高牛胰蛋白酶突变体活性和含量的制备方法。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种重组牛胰蛋白酶突变体以及制备重组牛胰蛋白酶突变体的方法。

本发明的另一个目的是提供一种在大肠杆菌中可溶性表达牛胰蛋白酶突变体的方法，将该方法制备得到的包含融合蛋白GST的重组牛胰蛋白酶突变体直接酶切去除融合蛋白GST后即可得到有活性的牛胰蛋白酶突变体，并且后续的纯化步骤也简单方便。