[发明专利]重组牛胰蛋白酶突变体及其制备方法

权利要求书

1.一种包含融合蛋白GST的重组牛胰蛋白酶突变体，其特征在于：包含融合蛋白GST的重组牛胰蛋白酶突变体序列结构从N端到C端依次包括A1-A2-A3-A4， 氨基酸序列为Seq IDNo.12，其中A1为融合蛋白GST，A2为A1和A3之间的柔性连接蛋白GSGS，A3为肠激酶识别位点DDDDK，A4为重组牛胰蛋白酶突变体。

2.根据权利要求1所述的包含融合蛋白GST的重组牛胰蛋白酶突变体，其特征在于：其中A1氨基酸序列为Seq ID No.1。

3.根据权利要求1所述的包含融合蛋白GST的重组牛胰蛋白酶突变体，其特征在于：其中A2核苷酸序列为Seq ID No.2。

4.根据权利要求1所述包含融合蛋白GST的重组牛胰蛋白酶突变体，其特征在于：其中A3核苷酸序列为Seq ID No.3。

5.根据权利要求1所述的包含融合蛋白GST的重组牛胰蛋白酶突变体，其特征在于：其中A4氨基酸序列为Seq ID No.5。

6.一种冷诱导表达载体pCOLDI，包含权利要求1所述的包含融合蛋白GST的重组牛胰蛋白酶突变体。

7.根据权利要求6所述的表达载体，其特征在于：包括包含融合蛋白GST的重组牛胰蛋白酶突变体，基因序列为Seq ID No.11，插入质粒pCOLDI的SacI/HindIII酶切位点。

8.一种包含重组牛胰蛋白酶突变体的工程菌，其特征在于：其包含权利要求7所述的表达载体。

9.一种包含重组牛胰蛋白酶突变体的工程菌，其特征在于：由将权利要求7所述的表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)而获得。

10.一种重组牛胰蛋白酶突变体的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)培养权利要求8或9任一所述的包含重组牛胰蛋白酶突变体的工程菌并诱导重组牛胰蛋白酶突变体基因的表达；

(2)收集菌体；

(3)破碎菌体；

(4)收集上清；

(5)纯化上清中的包含融合蛋白GST的重组牛胰蛋白酶突变体；

(6)重组牛胰蛋白酶突变体的活化；

(7)重组牛胰蛋白酶突变体的纯化。

11.根据权利要求10的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)培养包含重组牛胰蛋白酶突变体基因的工程菌并诱导重组牛胰蛋白酶突变体基因表达，具体为：接种重组工程菌阳性克隆100ul到20ml的LB培养基中，于30-37℃下摇床振荡培养过夜，按4%接种量接过夜菌于500ml的LB培养基，30-37℃下摇床振荡培养到对数期，接种到装有6L培养基的发酵罐中，初始参数为：发酵温度30-37℃，搅拌速度200-300rpm，通气量15L/min，pH为6.5-7.5，控制搅拌转速与通气量以维持溶氧始终在30%以上，培养基配方如下：发酵培养基：酵母浸出粉30g/L，葡萄糖6g/L，十二水合磷酸氢二钠8g/L，磷酸二氢钾4g/L，硫酸铵6g/L，七水硫酸镁1.13g/L，二水氯化钙0.073g/L，补料培养基：酵母浸出粉20g/L，葡萄糖30g/L，50%氨水和30%磷酸用于发酵过程中pH调控；当培养基中养分耗尽，溶氧迅速上升时开始补料，控制补料速度、转速、通气保证控制溶氧在30%以上；补料5hr-8hr后，降温至10-15℃，调节pH至6.5-7.5，加入终浓度0.1-1mmol/L的IPTG进行有氧诱导，溶氧不低于20%，继续培养10-24h后出罐，收集菌体。