[发明专利]一种新型双重靶向基因载体

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，提供了一种新型双重靶向基因载体。

技术背景

基因治疗被认为是治疗先天性遗传疾病、恶性肿瘤、传染病等重大疾病最有希望的治疗方案之一。基因载体可分为两类：病毒载体与非病毒载体。非病毒载体相对于病毒载体，具有安全性高、免疫原性低、制备简单，成本低等优点，越来越受到重视，而非病毒载体的缺点在于转染效率相对较低和缺乏靶向性。而非病毒载体要想取得较高的转染效率，必须克服3个障碍：避开血细胞、穿透细胞膜以及细胞核膜。传统的基因载体包括脂质体都带有较强的正电荷，以有效吸附负电性的基因物质，如，质粒，反义寡核苷酸片段，siRNA等。但是这种依靠正电吸附负载的基因物质有限，而且载体进入体内后，其正电性很容易被血液中的吞噬细胞识别、吸附并迅速清除。同时，正电荷会导致血细胞膜去稳定化，造成严重毒性，这些缺点都严重阻碍了正电荷基因载体的临床运用。

本发明采用中性磷脂制备脂质囊泡，采用PCR方法在其内部大量扩增基因片段，得到内部浓集基因物质的中性基因载体，大大提高载体包载基因的量，有利于传递更多目的基因至细胞，提高传递基因的效率。并且载体使用中性磷脂制备，其理化性质与细胞接近，具有良好的生物相容性，同时载体的表面电荷为中性，降低载体对细胞的毒性。但是载体的表面电荷为中性，与细胞的吸附力降低，不利于细胞的摄取。为提高载体的靶向性，帮助载体突破细胞膜与细胞核膜，对载体进行靶向性修饰。叶酸(FA)受体在多种肿瘤细胞表面高表达，因此通过叶酸受体提高肿瘤的靶向治疗效果，颇有应用前景。地塞米松进入细胞后，能够与细胞质内的糖皮质细胞受体结合，迅速进入细胞核，可以作为细胞核靶向基团。并且地塞米松只有细胞核靶向作用，对细胞没有亲和力，不会造成“脱靶效应”，是良好的细胞核靶向基团。本专利采用FA与地塞米松对载体进行修饰，制备新型双重靶向基因载体，具有较高的转染效率，毒性较低，具有广阔的应用前景。

发明内容

本发明提供一种新型双重靶向基因载体，该非病毒基因载体内部包载大量目的基因片段，同时具有细胞与细胞核双重靶向性，能够高效传递基因转染效率有较大提高。

为了达到上述目的，本发明的技术方案为：

一种新型双重靶向基因载体，通过叶酸-聚乙二醇-磷脂(FA-PEG₂₀₀₀-DSPE)和地塞米松对载体进行修饰，该双重靶向基因载体具有肿瘤细胞靶向性与细胞核靶向性；双重靶向基因载体内部包载大量目的基因片段，能够高效的传递基因；双重靶向基因载体表面为负电性，毒性降低。

上述新型双重靶向基因载体的制备方法，包括以下步骤：

将eggPC、DOPE、FA-PEG₂₀₀₀-DSPE和地塞米松在室温下溶于氯仿后，置于茄型瓶中，氮气吹干，制备脂质薄膜，然后加入PCR组分液，涡旋震荡水化，将PCR组分液包裹在脂质囊泡中，最后采用PCR方法扩增目的基因片段，得到包载大量目的基因片段的新型双重靶向基因载体。

所述的PCR组分液包括：0.1ng/μL的pDNA模板、0.025U/μL的Taq聚合酶、0.8μM的引物和0.2mM的dNTPs(每种均为0.2mM)；

所述的eggPC、DOPE、FA-PEG₂₀₀₀-DSPE和地塞米松的摩尔比为10:10:1:1。

所述的PCR方法扩增的具体步骤为：

①95℃反应30s；②95℃反应30s；③55℃反应2min；④72℃反应1min；⑤将步骤②～④重复20个循环；⑥72℃反应1min。

本发明的有益效果为：本发明提供一种能够高效传递基因的新型双重靶向载体。载体内部通过PCR扩增，包载大量目的基因片段，提高基因的传递效率；通过靶向基团FA-PEG₂₀₀₀-DSPE和地塞米松的修饰，可以增加载体的肿瘤细胞靶向性和细胞核靶向性，提高其转染效率；传统的脂质基因载体多采用阳离子材料，毒性大，体内转运效率低，而中性磷脂材料包载DNA效率低，不能用于基因传递。本发明采用中性磷脂囊泡包载PCR组分液，在其内部大量扩增DNA片段，使载体中包载的基因拷贝数大大增加，基因转染效率也显著提高。通过靶向修饰，使其同时具有细胞与细胞核靶向性，基因转染效率显著提高；制备载体采用中性磷脂，无正电荷成分，使其毒性明显降低。本发明方法设计合理，制备工艺简单，具有广阔的应用前景。

附图说明：

图1为透射电镜观察新型双重靶向基因载体形态的结果图；