[发明专利]一种耐受有机溶剂漆酶衍生物及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于医药学技术领域，尤其涉及一种耐受有机溶剂漆酶衍生物及其制备方法。

背景技术

漆酶(EC 1.10.3.2)是一种多铜氧化酶，从底物吸收电子，传递给氧气生成水，具有环保和高效的特点。漆酶底物范围很广，包括邻苯二酚、对苯二酚、多酚、甲氧基替代酚、氮羟基化合物、苯胺和呈现还原性的有机化合物。因为环保高效且具有广泛的底物谱，漆酶在很多领域都有巨大的应用潜力，如生物修复、生物合成、生成检测和生物质能源等等。在漆酶催化的反应往往需要在有机介质中进行，一般来说,在有机介质中酶催化反应具有以下优点:(1)增加反应物的溶解度；(2)使反应平衡发生移动；(3)分离简单。

然而，有机介质往往使漆酶的稳定性和活性较低，因此,需要对野生型漆酶进行改造，筛选耐受有机溶剂的漆酶突变体，

发明内容

本发明的目的在于提供一种耐受有机溶剂漆酶衍生物及其制备方法，旨在解决有机介质使漆酶的稳定性和活性降低的问题。

本发明是这样实现的，一种耐受有机溶剂漆酶衍生物，该耐受有机溶剂漆酶衍生物的突变体为T480A和T480F；所述T480A的核苷酸序列为SEQ ID NO1；所述T480F的核苷酸序列为SEQ ID NO2。

本发明的另一目的在于提供一种所述耐受有机溶剂漆酶衍生物制备的漆酶。

本发明的另一目的在于提供一种耐受有机溶剂漆酶衍生物的制备方法，其包括以下步骤：

引物的设计：把待突变的氨基酸的核苷酸序列换成突变后的核苷酸序列，再加上突变位点前后各6个氨基酸的核苷酸序列组成正向引物，再把正向引物反向互补得到反向引物；T480A的正向引物核苷酸序列为SEQ ID NO3；T480A的反向引物核苷酸序列为SEQ ID NO4；T480F的正向引物核苷酸序列为SEQ ID NO5；T480F的反向引物核苷酸序列为SEQ ID NO6；

Dpn Ⅰ酶切消化：分别用正反向引物对pGEX6P-1-CotA质粒进行扩增，扩增条件:94度,5分钟；94度,1分钟；68度,30秒；72度,1分钟；循环30次；72度,5分钟；冷却到4度；

退火：将酶切后产物混合，72℃反应10min后室温退火；

纯化回收：将退火后的产物用试剂盒纯化回收；

转化：将回收产物转化到感受态DH5α中；

测序：将转化平板中的菌落送去测序验证，得到耐受有机溶剂漆酶衍生物的突变体T480A菌株和T480F菌株。

进一步，得到耐受有机溶剂漆酶衍生物的突变体T480A菌株和T480F菌株后还需进行突变体蛋白的纯化；突变体蛋白的纯化方法包括：

(1)离心收集过夜诱导的菌体，重悬浮于50mMNaCl,25mMTris-HCl pH 8.0的Buffer中，超声破碎；

(3)将破碎后的菌体12000rpm离心30min，将上清液进行GST亲和层析，并在亲和柱中加入PPase过夜酶切，以去除融合蛋白中的GST标签；

(4)将PPase酶切后的突变体蛋白进行Resource Q和Mono Q的离子交换纯化。

进一步，所述突变体蛋白的纯化前需进行蛋白的培养；蛋白的培养方法包括：

1)将保存在-80℃的突变体菌株划线到LB固体平板中，37℃过夜活化；

2)从活化好的固体平板中挑起单菌落于10ml有氨苄抗性的液体LB培养基中，37℃、200rpm过夜活化做种子液；

3)按0.5％的接种量将种子液接种于1L有氨苄抗性的液体LB培养基中，37℃、200rpm培养；

4)当OD600为0.6时，加入IPTG使终浓度为0.2mM，加入硫酸铜使终浓度为0.25mM，18℃、180rpm过夜诱导。