[发明专利]一种用于检测4/91型传染性支气管炎病毒的试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，特别是涉及一种用于检测4/91型传染性支气管炎病毒的试剂盒及其应用。

背景技术

传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)属于冠状病毒科(Coronaviridae)，冠状病毒属(Coronavirus)，是有囊膜单股正链RNA病毒，其基因组长度约为27.6kb。IBV基因组编码4种必需结构蛋白：纤突蛋白(S)、膜蛋白(M)、核衣壳蛋白(N)和小膜蛋白(E)。纤突蛋白、膜蛋白是主要表面蛋白，位于病毒粒子最表层的囊膜上，是构成冠状病毒纤突的主要成分。IBV不同毒株间S基因的核苷酸序列变化幅度较大，有些可达50％以上，不同IBV毒株S蛋白的氨基酸变异多发生在S1上。Sl蛋白也是IBV血清型特异性抗原决定簇的主要蛋白，对IBV的组织嗜性及其毒力具有一定影响，能诱导机体产生特异性抗体。

由于IBV基因组RNA复制的不连续性以及RNA聚合酶的不完全校对机制，使得IBV基因组十分容易发生突变、缺失、插入和不同毒株基因组间的同源重组，造成IBV血清型众多，IBV新的血清型也不断出现，但QX-like型IBV是世界范围内主要流行毒株，，4/91型IBV疫苗对该流行株具有较好的交叉保护效果，因此生产中常常需要对疫苗中4/91型IBV毒株进行鉴定，确定疫苗中是否含有4/91型IBV毒株，以保证疫苗的免疫效果。因此，对4/91型IBV进行特异性鉴定是预防和控制本病的关键一环。已经建立多种IBV的诊断方法，如中和试验、ELISA、血凝和血凝抑制试验等，这些方法虽已属常规技术，但具体应用到IBV检测中，或因IBV血清型间抗原差异大而敏感性降低，导致漏检；或因常规血清学方法本身的缺陷而出现假阳性，造成误检。传统的病毒分离方法，对采集病料的时机和病料的新鲜程度要求较高，需要接种9-11日龄鸡胚进行传代观察胚变，以及用多种标准阳性血清进行鸡胚中和试验，且检测周期往往要几周以上，具有明显的局限性。

RT-PCR技术是一种快速、敏感、特异的分子生物学检测方法。80年代该技术的产生给病毒检测提供了一种新的选择，在检测各种病毒中得到了广泛应用。IBV众多血清型中的序列同源性较高，不断有新的变异株产生，为快速诊断IBV血清型带来了困扰。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供用于检测4/91型传染性支气管炎病毒的特异性引物对。

本发明的第二个目的在于提供检测4/91型传染性支气管炎病毒的试剂盒。

考虑到IBV众多血清型中序列同源性较高，寻找各血清型之间的差异并确定各差异的保守序列以及从S1基因高变区选择靶区域是本领域的技术难点，本发明参照GenBank登录的4/91型IBV-S1基因序列(GenBank登录号为KF377577)的高变区设计并筛选特异性引物。IBV-S1蛋白为IBV变异程度最大的结构蛋白。在众多备选的引物中，经过多次筛选，比对试验，以排除引物与其他物种序列可能存在的非特异性匹配，最终获得优化后的引物对。

本发明提供的优选的特异性引物对，其序列为：

上游引物5’-TCTGATTGCACTGCTGGTACT-3’(SEQ ID NO.1)；以及下游引物5’-GCACCCGTAACGTGAGTTG-3’(SEQ ID NO.2)。

上游引物在GenBank登录号为KF377577的20500nt-20520nt之间，下游引物在20858nt-20876nt之间。提取样本总RNA并进行反转录(RT)合成cDNA后，利用上述引物进行聚合酶链式反应(PCR)，采用下列反应程序：起始变性94℃5min，30个循环(94℃45s，58℃45s，72℃25s)，最后经过72℃10min延伸，对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，利用紫外凝胶成像仪检测目的条带，如果扩增出目的条带则证明为4/91型IBV检测阳性，否则为阴性。

本发明提供了上述特异性引物对在制备鉴别传染性支气管炎病毒血清型试剂盒中的应用。

本发明提供了上述特异性引物对在制备检测4/91型传染性支气管炎病毒试剂盒中的应用。

含有SEQ ID NO.1-2所示特异性引物对的检测试剂属于本发明的保护范围。

含有SEQ ID NO.1-2所示特异性引物对的试剂盒属于本发明的保护范围。

进一步地，本发明的试剂盒其PCR阶段的工作程序为：94℃5min；94℃45s，58℃45s，72℃25s，30个循环；72℃10min。