[发明专利]实时荧光PCR鉴别蓝莓成分的组合物、试剂盒和方法

说明书

本发明涉及蓝莓成分的实时荧光PCR方法。本发明还涉及用于所述方法的寡核苷酸引物探针组合物。本发明还涉及包含所述组合物的实时荧光PCR试剂盒。使用本发明的组合物进行实时荧光PCR检测，能够通过简单、快速、特异且灵敏地检测果干、果酱、果汁（清汁除外）等食品中蓝莓源性成分。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体而言，本发明涉及用于定性检测蓝莓成分Taqman实时荧光PCR方法，用于所述方法的寡核苷酸引物探针组合物，以及包含所述组合物的试剂盒。

背景技术

蓝莓狭义上是指一群在植物分类系统上越橘属（Vaccinium）越橘亚属青液果组（学名：Cyanococcus）的开花植物，广义上包括越橘属中长有蓝色浆果的所有物种，是一种新兴的小浆果类果树。根据树体特征、生态特性及果实特点，蓝莓划分为兔眼蓝莓、南高丛蓝莓、北高丛蓝莓、半高丛蓝莓、矮丛蓝莓五个品种群。蓝莓果实营养丰富，除蛋白质、脂肪、碳水化合物，VA、VE、超氧化物歧化酶(SOD)等，蓝莓的微量元素含量也很高，鲜果中含钙、磷、镁、锌、铁、锗、铜等。除含有常见的营养成分外，蓝莓果实中还含有丰富的花青苷等营养成分，因此，常被誉为“浆果之王”、“水果皇后”，具有较高经济价值和广阔的开发前景。

随着蓝莓及其果干、果酱、果汁等产品风靡世界，其丰富的营养价值、高昂的价格促使蓝莓掺假现象愈演愈烈，亟需开发简便、快捷的真伪鉴别技术。以往对其进行的研究主要集中在液相色谱、质谱、色质联用以及光谱等常规理化技术上，但理化方法特异性不强、检测费用高，易受原料种类和产地的影响。随着分子生物学技术的快速发展，基于DNA的各种分子生物学技术通过检测物种特异性基因片段来判断物种成分，具有特异性强，灵敏度高，不易受环境条件干扰，结果稳定等优点，在蓝莓等小浆果的鉴定中的应用越来越广泛。

发明内容

本发明的目的在于，简单、快速、特异且灵敏地检测食品及果汁（清汁除外）中的蓝莓成分，能有效防止果汁、果酱等蓝莓产品中添加其他廉价水果的造假方式。

本发明的发明人根据果蔬内参基因NADH，设计了能够通用于果蔬内参照的实时荧光PCR检测方法；以蓝莓叶绿体matk 基因为目标，设计了能特异性检测蓝莓成分的引物和探针，靶序列244 bp，保证能从果酱、果汁等沉淀中检测目标植物成分。

在本发明的一个方面，提供了通用于果蔬成分内参照的寡核苷酸引物上游NADH-F: 5’-GCTGAAGCAGCTACTTTCGAAGTAACA-3’（SEQ ID No.1），和下游NADH-R: 5’-AGGAGCCGTGTGAGATGAAAGTCTCA-3’（SEQ ID No.2）。探针为NADH-P: 5’-TGGAGTGGGAGAGTCAGAGTCGAAAAGAGG-3’（SEQ ID No.3），在探针的3’端连接有一个荧光淬灭基团TAMRA，5’端连接有一个荧光报告基团FAM。该引物可特异性识别果蔬成分的NADH序列，扩增片段长度138 bp。特异性扩增反应条件为：50℃ 2 min；95℃预变性 10 min；95℃ 15s，60℃ 1 min，40个循环。

在本发明的一个方面，还提供了特异性检测蓝莓成分的特异性寡核苷酸引物上游Buleberry-F：5’-AGCAACATGACGTCATATATCCACT-3’（SEQ ID No.4），和下游Buleberry-R：5’- GAATACAAATTTGTATTGTACCCCA -3’（SEQ ID No.5）。探针为Buleberry-P：5’-TGCACTTGCTCATGATCGTGGTTTAAATAGATT-3’（SEQ ID No.6），在探针的3’端连接有一个荧光淬灭基团TAMRA，5’端连接有一个荧光报告基团FAM。该引物可特异性识别蓝莓的matk序列，扩增片段长度244 bp。特异性扩增反应条件为：50℃ 2 min；95℃预变性 10 min；95℃ 15 s，60℃ 1min，40个循环。

在本发明的另一个方面，提供了包含上述寡核苷酸序列的组合物，所述组合物包含选自以下（1）至（2）中的任意一组或多组引物和探针序列：