[发明专利]一种CAR‑T细胞冻存介质及冻存方法

说明书

技术领域

本发明公开了一种CAR-T细胞冻存介质及冻存方法，属于细胞治疗技术领域。

背景技术

免疫细胞治疗是继手术、化疗、放疗和靶向疗法后出现的一种新型疗法，被称为治疗癌症的“第五大疗法”。尽管免疫治疗历经了多年断断续续的发展，但是其研究正在取得越来越多令人激动的结果，因此被顶级学术期刊《科学》杂志评为2013年十大科学突破之首。

其中，CAR-T免疫细胞治疗(Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy，嵌合抗原受体T细胞免疫疗法)，是利用基因工程技术手段，特异性改造患者本身的免疫T细胞，使其能够识别病变癌症细胞，从而实现特异性杀伤的作用。

CAR-T一般治疗流程是：(1)先从癌症病人身上分离出免疫T细胞；(2)利用基因工程技术手段对其进行特定基因改造，使T细胞表面表达一种能识别肿瘤细胞、并且同时激活T细胞杀死肿瘤细胞的嵌合抗体(Chimeric Antigen Receptor,CAR)，T细胞转变成CAR-T细胞，进而能靶向杀死癌细胞；(3)体外培养，大量扩增CAR-T细胞；(4)把扩增好的CAR-T细胞输回病人体内，特效杀死癌细胞。

因此，在CAR-T细胞体外大量扩增培养后，为方便细胞长期保存和长距离运输，有效的冻存细胞，并且保持细胞特性不变，对CAR-T疗法的临床应用极为重要。因此，本专利阐述了在CAR-T细胞体外培养后的超低温冻存方法及细胞冻存介质的制备方法。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种CAR-T细胞的超低温冻存方法。

本发明的另一目的是提供一种CAR-T细胞冻存介质的制备方法。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种CAR-T细胞冻存方法，包括以下步骤：

(1)将培养的CAR-T细胞转移至离心管中，在200-500g条件下，离心5-8min，弃掉上清液；

(2)将离心后的细胞团先用DPBS重悬，确认细胞团被完全打碎，在磁力架上静止2-5分钟，实现细胞跟磁珠的分离；

(3)用移液管将细胞悬液转移至新的离心管中，重复去磁珠操作两次；

(4)将清除磁珠后的细胞悬液在200-500g条件下，离心5-8min，弃掉上清液，备用；

(5)根据需要冻存的细胞总数量，计算冻存介质的体积，将细胞重悬于冻存介质中；

(6)将细胞分装于冻存管或者冻存袋中，放置于-80℃超低温冰箱中缓慢冷冻8-18小时，或者放置于程序降温仪中按照相应程序降温至-85℃；降温结束后，将细胞冻存管或者冻存袋转移至液氮中长期保存。

回输需要时，在液氮条件下运送至治疗医院，在37℃条件下快速解冻后，可以直接回输给治疗病人。

所述步骤5中的冻存介质由氯化钠、二甲基亚砜、葡萄糖、人血白蛋白、低分子葡聚糖和RPMI-1640基础培养基组成，其中氯化钠的质量浓度为0.45-0.9％，二甲基亚砜溶液的体积浓度为5-15％，葡萄糖的质量浓度为5-20％、人血白蛋白的质量浓度为10-50％，低分子葡聚糖的质量浓度为5-20％。

优选的，所述步骤5中的冻存介质，其中氯化钠的质量浓度为0.9％，二甲基亚砜溶液的体积浓度为10-15％，葡萄糖的质量浓度为5-10％、人血白蛋白的质量浓度为10-30％，低分子葡聚糖的质量浓度为5-10％。

进一步优选的，所述步骤5中的冻存介质，其中氯化钠的质量浓度为0.9％，二甲基亚砜溶液的体积浓度为10％，葡萄糖的质量浓度为5％，人血白蛋白的质量浓度为10％，低分子葡聚糖的质量浓度为5％。

所述步骤5中CAR-T细胞的冻存密度为1×10⁶个/ml-500×10⁶个/ml。

本发明还提供了一种可用于各种CAR-T细胞的冻存介质。

一种CAR-T细胞的冻存介质，由氯化钠、二甲基亚砜、葡萄糖、人血白蛋白、低分子葡聚糖和RPMI-1640基础培养基组成，其中氯化钠的质量浓度为0.45-0.9％，二甲基亚砜溶液的体积浓度为5-15％，葡萄糖的质量浓度为5-20％、人血白蛋白的质量浓度为10-50％，低分子葡聚糖的质量浓度为5-20％。

优选的，所述氯化钠的质量浓度为0.9％，二甲基亚砜溶液的体积浓度为10-15％，葡萄糖的质量浓度为5-10％、人血白蛋白的质量浓度为10-30％，低分子葡聚糖的质量浓度为5-10％。