[发明专利]一种利用犹他游动放线菌转化棘白菌素B的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物制药领域，涉及一种利用犹他游动放线菌转化棘白菌素B的方法，尤其涉及一种通过犹他游动放线菌细胞固定化的方式高效转化棘白菌素B的方法。

背景技术

20世纪70年代，人们发现棘白菌素类(Echinocandin)药物能够非竞争性地抑制真菌细胞壁β-1,3-葡聚糖合成酶的活性，并且表现出抗菌谱广、活性强的特点，是治疗免疫抑制患者和免疫正常患者真菌感染的重要选择药物，主要作用于念珠菌属(Candidas)和曲霉菌属(Aspergillus)。棘白菌素类主要有三种类型，其中棘白菌素B(Echinocandin B)是最为重要的类型，将棘白菌素B去侧链之后得到半合成前体母核，经过一系列的化学修饰可以得到具有广泛临床应用前景的衍生物，其代表性药物如卡泊芬净(Caspofungin)、阿尼芬净(anidulafungin)先后于02年、06年上市。

半合成前体母核的制备是棘白菌素类药物生产的关键步骤，通常采用犹他游动放线菌发酵产生的酰胺水解酶对棘白菌素B进行转化，去除侧链制备棘白菌素B母核。早期的转化方法是直接将棘白菌素B底物添加到酰胺水解酶发酵体系中转化，该方法存在稳定性差、转化率低等缺点。后有研究者将酰胺水解酶基因在链霉菌中表达，制备成游离酶或者固定化酶，然后再建立稳定的转化体系进行转化，但游离酶的制备和固定化都需要繁琐的酶纯化过程，生产成本较高。

发明内容

针对现有技术的缺陷，本发明的目的在于通过犹他游动放线菌细胞固定化的方式，提供一种转化率高、能多次重复使用、稳定性好、工艺简单、具有明显成本优势的转化棘白菌素B的方法。

为了实现本发明的目的，发明人通过大量试验研究，最终获得了如下技术方案：

一种利用犹他游动放线菌转化棘白菌素B的方法，包括如下步骤：

(1)犹他游动放线菌经过培养得到菌液，离心收集菌体，悬浮于缓冲盐水溶液中，加入海藻酸钠水溶液，混匀后平稳的注入CaCl₂水溶液中进行固定化，将所得固定化小珠装柱备用；

(2)将棘白菌素B溶解于有机溶剂中，然后加入缓冲盐水溶液中，使棘白菌素B的浓度为0.1～5g/L，再缓慢加入到步骤(1)得到的柱子中进行转化。

上述利用犹他游动放线菌转化棘白菌素B的方法，其中步骤(1)和(2)中所述的缓冲盐水溶液为pH5.0～6.5的磷酸盐水溶液或者醋酸盐水溶液。

上述利用犹他游动放线菌转化棘白菌素B的方法，其中步骤(1)中所述的海藻酸钠水溶液质量体积浓度为1％～3％。

上述利用犹他游动放线菌转化棘白菌素B的方法，其中步骤(1)中所述的CaCl₂水溶液浓度为0.1～0.3mol/L。

上述利用犹他游动放线菌转化棘白菌素B的方法，其中步骤(1)中固定化步骤控温20～40℃，时间10～40min。

上述利用犹他游动放线菌转化棘白菌素B的方法，其中步骤(2)中所述的有机溶剂为乙醇、甲醇和丙酮中的一种或多种。

上述利用犹他游动放线菌转化棘白菌素B的方法，其中步骤(2)中转化温度为20～40℃，转化时间为6～24h。

与现有技术相比，本发明涉及的棘白菌素B转化方法具有如下优点和显著的进步：通过一定的方法直接将犹他游动放线菌的细胞进行固定化，而不经过酶的纯化过程，建立了稳定的固定化细胞转化体系，具有工艺简单、成本低廉的显著优势，且制备得到的固定化细胞具有稳定性好、转化率高且能多次重复使用的优点。

具体实施方式：

实施例一：

1.细胞培养及固定化

将犹他游动放线菌(actinoplanes utahensis)接种至平板培养基，25℃培养10天；将平板培养的菌体接种到种子培养基中，25℃培养12h；将种子液接种到发酵培养基中，接种量体积百分比10％，28℃培养24h。离心收集菌体50g，悬浮于50mL pH为5.0的磷酸盐缓冲液中，加入100mL质量体积分数2％海藻酸钠溶液混匀，之后用注射器平稳的注入0.1mol/L的

CaCl₂溶液中，25℃固定化40min。之后，过滤得到约2mm的固定化小珠，用pH5.0的磷酸盐缓冲液清洗准备装柱。

2.装柱

将制备好的细胞固定化小珠均匀悬浮于pH5.0的磷酸盐缓冲液中，加入到直径5cm、高度20cm的玻璃柱中，避免气泡出现。用pH5.0的磷酸盐缓冲液冲洗干净备用。

3.过柱转化