[发明专利]一种鉴定地龙的PCR方法

说明书

技术领域

本发明涉及中药及中药材、中药提取物鉴定技术领域，特别是一种能够特异性鉴定金钱白花的PCR方法及其特异引物。主要用于地龙药材、地龙提取物、极限条件提取物，含有地龙的制剂以及极限条件处理的地龙制剂快速鉴定。

背景技术

地龙为药用蚯蚓，具有，主要有降压、抗血栓、抗心律失常、抗癌、增强免疫、抗淸痕、解热镇痛、镇静、平喘、抗菌等作用。此外，从广地龙中还发现了多种具有药理活性的成分如蚯蚓纤溶酶、蚓激酶、蚯蚓素、蚯蚓解热碱、蚯蚓毒素、碱性氨基酸、次黄嘿呤、黄嘿呤、琥拍酸和脂肪酸以及钙调素蛋白即蚯蚓新钙结合蛋白等，这些成分在调节细胞多种生理功能中起着重要调节作用。广地龙在行业内被公认为品质最优的道地药材，不仅是国内销售中的抢手货，而且还是出口创汇的指定品种，不论其作为药品、还是营养保健品开发利用，在经济、社会和生态方面都有巨大的效益潜力。

PCR方法：PCR是聚合酶链式反应的简称，是一种酶促化学反应，可以在试管里将待测的目的基因在很短的时间内扩增物十万倍乃至上百万倍，大大提高了基因诊断的灵敏度，降低了分析的难度。PCR法是目前基因诊断中使用最多的方法。

国内虽已有PCR方法鉴定地龙药材的报道，但鉴定极限条件处理后的药物制剂中地龙的PCR方法至今未见报道。由于在制剂的生产过程中，存在粉碎、混合等环节，水煎煮提取、醇煎煮提取等工艺环节，甚至是高温高压等条件处理，这些条件要么使地龙粉末变为混合物，要么使地龙因提取过程而被破坏掉大量有机成分，使得制剂中地龙的鉴定变得困难。而有的制剂使用多种动物类药材，或者使用多种动物类药材，使得其它几味动物类药材也存在干扰鉴定的可能，因而使制剂中地龙的鉴定变得十分困难。

发明内容

本发明提供了一种用于鉴定地龙药材、地龙提取物、极限提取物以及含地龙制剂、极限条件处理后的制剂的引物及鉴定方法，该PCR鉴定方法操作简单，能快速准确的鉴定地龙粉末、提取物、极限提取物、混合制剂、甚至极限条件下处理的制剂。

一对鉴定地龙的特异引物：上游引物、下游引物，其序列为：

上游引物：5’-AAAGCTTCCAACTGGGATTAGATACCCCACTAT-3’

下游引物：5’-TGACTGCAGAGGGTGACGGGCGGTGTGT-3’

一种地龙的PCR鉴定方法，包括以下步骤：分为以下四个步骤：

1、制备样品：制备地龙粉末、采用加热冷凝回流装置制备地龙水提物、醇提物和高压制备极限条件提取物，混合得到地龙制剂并高压制备极限条件处理后的地龙制剂。

2、样品DNA提取：从以上样品中提取DNA。

3、PCR反应：采用PCR方法得到PCR产物，95℃5min，35个循环(95℃30s，58℃30s，72℃30s)，72℃5min，得到扩增产物。

4、以电泳鉴定扩增产物大小，以此鉴定地龙真伪，通过实验验证方法的稳定性。方法：1.5％凝胶、130V电泳25min，在230bp处有单一条带，则确定所检材料为地龙。

附图说明

图1为地龙鉴定电泳图，示出地龙粉末和其他动物药材粉末的PCR鉴定结果，结果如图1所示，地龙在230bp处有均一条带，而其他易混淆品没有条带说明该方法可区分地龙粉末与易混淆品。注：M为Marker，从上到下依次为1000bp、700bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp，1～3为地龙粉末，4～5为全蝎粉末，6～7为蜈蚣粉末，8～9为土鳖虫粉末。条件：95℃5min，38个循环(95℃30s，58℃30s，72℃30s)，72℃5min。

图2为地龙鉴定电泳图，示出地龙水提物和醇提物的PCR鉴定结果。地龙水提物、醇提物提取物均在230bp处有均一条带，说明该方法可鉴定地龙的提取物。注：M为Marker，从上到下依次为1000bp、700bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp，1～2为地龙水提物，3～4为地龙醇提物，5为全蝎水提物，6为全蝎醇提物，7为蜈蚣水提物，8为蜈蚣醇提物，9为土鳖虫水提物，10为土鳖虫醇提物。条件：95℃5min，35个循环(95℃30s，58℃30s，72℃30s)，72℃5min。