[发明专利]一种分枝杆菌分型的高通量测序方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种分枝杆菌分型的高通量测序方法。

背景技术

分枝杆菌是人类历史上最重要的病原微生物群之一。分枝杆菌属的250多种菌种中，结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、田鼠分枝杆菌和非洲分枝杆菌等因生物学特性接近又称为结核分枝杆菌复合群。分枝杆菌属中除结核分枝杆菌复合群和麻风分枝杆菌（临床上已少见）以外的分枝杆菌统称为非结核分枝杆菌，例如鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌等。

人结核病的主要病原菌是结核分枝杆菌、牛分枝杆菌等结核分枝杆菌复合群的菌株。结核分枝杆菌是引起结核病的病原菌，可侵犯全身各器官，但以肺结核为最多见。结核病至今仍为重要的传染病。据WHO报道，每年约有800万新病例发生，至少有300万人死于该病。结核分枝杆菌是典型的胞内致病菌，通过进化获得一系列毒力成分，又通过多种机制抑制宿主免疫应答，逃逸免疫监视，导致结核病的发生。但结核病确切的发病机制尚不清楚，这给结核病的有效防治造成了极大困难。随着预防接种、抗结核药物的不断发展和卫生生活状况的改善，结核的发病率和死亡率曾一度大幅下降。但是，近年来世界各地结核分枝杆菌的多耐菌株逐渐增多，甚至引起暴发流行，发病率又有上升趋势。因此，结核病又成为了威胁人类健康的全球性卫生问题。非结核分枝杆菌(Nontuberculosis mycobacteria，NTM)特性有别于结核分枝杆菌，如对酸、碱比较敏感;对常用的抗结核菌药物较耐受;生长温度不如结核分枝杆菌严格;它是一种环境分枝杆菌，主要存在于自然环境中，但可以通过动物或医疗器械消毒灭菌不彻底而传染给人。它在自然界如空气、水和土壤中广泛存在，一般不致病。自20世纪80年代以来，随着艾滋病感染者人数的增加，播散性NTM感染以及以往认为非致病的分枝杆菌引起人类疾病的报道不断增多，有报道NTM的耐药率为95.9%；耐多药率为83.7%。1999年上海第一肺科医院报道，15年间5592例痰抗酸杆菌阳性患者中经鉴定为非结核分枝杆菌者173例中有咳嗽症状者占78%，咯血者58%，发热者26%，有空洞者40%。表明有一定致病性。非结核分枝杆菌从结核样病人分离的阳性率，我国为3%～15%。然后，随着结核病的回潮，非结核分枝杆菌感染率急速上升。我国现有结核病患者700万，据2010年第五次全国结核病流行病学调查，其中非结核分枝杆菌的感染率为22.9％，对人类致病的NTM有20余种。近年来，NTM病呈快速增多趋势，并己成为威胁人类健康的重要公共卫生问题。结核杆菌感染引起的肺结核病和非结核分枝杆菌（NTM）肺病二者在临床特点极其相似，临床上极易将NTM肺病误诊或漏诊为肺结核病，不同菌种感染引起的疾病治疗方案是截然不同的，尤其是不同的NTM引起的NTM病，在化疗方案的选择和用药时间都各不相同。有研究认为62％抗结核治疗效果不佳的肺结核为NTM感染，也就是说临床上误将NTM肺病当肺结核病治疗导致治疗效果不佳的现象比较常见。因此，2012年我国专家在诊断和治疗分枝杆菌病达成了一个共识，要求在诊断和治疗前进行分枝杆菌菌种鉴定，鉴定出是结核分枝复合群感染还是非结核分枝杆菌感染、以及是何种非结核分枝杆菌感染，以便能对不同分枝杆菌感染进行对症治疗。所以，在分枝杆菌感染、预防和治疗中，及时、准确地鉴定分枝杆菌对保护人类健康具有重要意义。

临床上对结核和非结核分枝杆菌肺病很难作出鉴别诊断，只能从标本中分离出分枝杆菌作菌种鉴定，才能确诊。分枝杆菌属的表型鉴定一直沿用以生化实验为核心的传统鉴定方法，传统的分枝杆菌菌种鉴定缺点是耗时长，步骤繁琐，污染大，价格高，缺乏可重复性，欠缺数值分类，需要有经验的专家而且可能产生模棱两可的结果。近年来，随着分子生物学诊断技术的不断进步，分枝杆菌菌种鉴定方法得到了很快的发展。常用的方法有PCR-RFLP、PCR-直接测序法和DNA probe等，这些方法各有优缺点，仍然不能满足临床的需要，因此，急需建立快速、简便、准确的分枝杆菌菌种鉴定方法。

利用分枝杆菌已有数据库，在第二代高通量测序技术帮助下，可以更好、更快速、更准确的为鉴定分枝杆菌提供更全面的信息。本专利利用二代高通量测序技术检测分枝杆菌杆菌基因序列，有如下优势：缩短了对分枝杆菌鉴定所需时间，可以一次检测全部分枝杆菌基因，获取分枝杆菌基因全部的信息，可以更全面的鉴定分枝杆菌的信息，有助于医生更准确制定治疗方案，减少患者的痛苦。

因此，利用二代高通量测序技术鉴定分枝杆菌的菌种，可以为医生提供患者所感染分枝杆菌的菌种信息，有助于医生更准确制定治疗方案，减少疾病的治疗疗程、成本和不良反应的发生。

发明内容