[发明专利]一种新金色分枝杆菌来源的甾酮C27-单加氧酶及其应用

说明书

本发明公开了一种新金色分枝杆菌来源的甾酮C27‑单加氧酶及其应用，属于基因工程和酶工程技术领域。本发明通过基因敲除及加强表达的方法，在新金色分枝杆菌中筛选到甾醇边链降解过程中关键酶SMO的三个同工酶。将其分别在高产雄甾二烯二酮(ADD)的新金色分枝杆菌中加强表达，ADD产量得到明显提高，其中SMO2的效果最明显。通过过量表达SMO2，ADD最终产量从5.2g/L提高到7.3g/L。本发明为微生物发酵法提高ADD产量的工业化提供了有益的指导。

技术领域

本发明涉及一种新金色分枝杆菌来源的甾酮C27-单加氧酶及其应用，属于基因工程和酶工程技术领域。

背景技术

甾体激素类药物因其多种生理功能，对机体起着非常重要的调节作用，故在临床上具有广泛的应用。甾体激素类药物被广泛用于抗肿瘤、抗炎症、抗菌、抗病毒、抗激素和抗过敏等。此外，各类性激素类药物是治疗性器官退化和妇科疾病的主要药物，是口服避孕药的主要成分。同时甾体激素类药物还可以作为抗肥胖药物的活性成分，用于预防冠心病以及作为HIV整合酶的抑制剂，预防HIV的传染和用于艾滋病的治疗等。雄甾-4-烯-3,17-二酮(AD)和雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮(ADD)作为甾体激素类药物的重要中间体，几乎可以合成所有的甾体激素类药物，在甾体的工业化生产中占有重要的地位。

目前制备AD和ADD主要有两种途径：一是从野生中草药黄姜、穿地龙等植物中提取薯蓣皂苷元，然后进行化学合成。但该途径存在生产成本高、过程复杂、环境污染严重等问题；二是以自然界中丰富存在的动植物甾醇为原料，通过微生物发酵技术对甾醇侧链进行选择性降解而得到目的产物。微生物法具有成本低、对环境温和等优点，越来越受到人们的重视。世界先进国家目前进行甾体药物制备，大多以动植物甾醇为起始原料进行微生物转化，得到甾体药物中间体后，再进一步制备。

众多学者对微生物转化甾醇合成AD/ADD进行了大量的研究，其中分枝杆菌是生产AD/ADD的优良菌株之一。已有报道微生物转化甾醇合成AD/ADD的代谢途径需要很多的酶，但是具体的是那些酶参与还没有完全研究明白。目前研究的进展是仅仅鉴定和证明了甾醇转化的第一步酶胆固醇氧化酶和最后一步酶3-甾酮-Δ¹-脱氢酶。其他途径中的酶还未鉴定和应用。

因此，有必要对分枝杆菌转化甾醇合成AD/ADD过程中的关键酶及其功能鉴定进行深入研究，以期在此基础上开发可促进分枝杆菌转化甾醇合成AD/ADD的方法。

发明内容

为了解决上述问题，本发明通过基因敲除及回补的方法，首次在新金色分枝杆菌中筛选到甾醇边链降解过程中关键酶甾酮C27-单加氧酶(SMO)的三个同工酶(SMO1，SMO2，SMO3)。分别将这三个同工酶在高产雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮(ADD)的新金色分枝杆菌中加强表达，ADD产量都得到明显提高，其中SMO2的加强表达对提高ADD的产量效果更明显。新金色分枝杆菌中甾酮C27-单加氧酶的功能鉴定和应用均为首次报道，且重组菌对提高ADD的产量较明显。加强表达SMO2基因的菌株的ADD最终产量从5.2g/L提高到7.3g/L。

本发明的第一个目的是提供一种甾酮C27-单加氧酶，所述甾酮C27-单加氧酶的氨基酸序列如SEQ NO.4、SEQ NO.5或SEQ NO.6所示。

本发明的第二个目的一种ADD产量提高的新金色分枝杆菌重组菌，所述重组菌是过表达了甾酮C27-单加氧酶基因的新金色分枝杆菌；所述甾酮C27-单加氧酶基因是基因Smo1、Smo2、Smo3中的任意一个或者两个以上。

在本发明的一种实施方式中，所述甾酮C27-单加氧酶基因Smo1的氨基酸序列如SEQ NO.4所示，核苷酸序列如SEQ NO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述甾酮C27-单加氧酶基因Smo2的氨基酸序列如SEQ NO.5所示，核苷酸序列如SEQ NO.2所示。