[发明专利]猪皮中分离纯化的皮抑素G1的活性成分四连接素及其应用

说明书

本发明属于生化分离技术领域，具体涉及一种猪皮中分离纯化的皮抑素G1的活性成分四连接素及其应用。本发明采用生化分离纯化技术，结合分子生物学技术，首次证明表皮细胞抑裂素中对表皮细胞有丝分裂有抑制作用的主要活性成分为四连接素(Tetranectin,TN)，所述猪四连接素由181个氨基酸组成，分子量19792.9，pI为5.75，TN为从猪皮制备的皮抑素G1的主要活性物质，可以制备成治疗银屑病的药物。

技术领域

本发明属于生化分离技术领域，具体涉及一种猪皮中分离纯化的皮抑素G1的活性成分四连接素及其应用。

背景技术

皮抑素G1具有明显的抑制表皮细胞有丝分裂的活性，因此可以作为缓解银屑病症状的药物，但半个多世纪来皮抑素G1既未用于治疗银屑病，亦未得到纯化，因此人们对其主要活性成分的化学性质知之甚少。目前有关皮抑素G1的研究除发明专利ZL201410036118.X外,未见其他报。

发明内容：

本发明需要解决的问题是探索皮抑素G1的主要活性成分，了解其化学结构和性质及其在制备治疗银屑病药物中的应用。本发明从猪皮经部分纯化得到的皮抑素G1开始，进一步纯化，通过阳离子交换凝胶层析，制备性SDS-PAGE,分离后将活性成分抽提物送质谱鉴定，发现在各蛋白成分中含量最高的成份为猪四连接素，和磷脂酰乙醇胺结合蛋白(PEBP)。通过DNA重组技术，在大肠杆菌中成功表达了四连接素(TN)和PEBP两种蛋白，并证实了TN具有很高的抑制活性，TN的单体活性更高，而PEBP虽然也有肯定的活性；但与TN比较则活性较低；显示皮抑素G1中主要的具有抑制活性的成分为TN。

本发明所述猪四连接素由181个氨基酸组成，分子量19792.9，pI为5.75，其氨基酸序列为：

本发明以皮抑素G1为起始材料，通过阳离子交换凝胶SP-sepharos FF柱层析，层析柱用pH 6.8 0.02mol/L,PBS平衡后，将皮抑素G1调节pH至6.8上柱分离，最早出现一个极大的穿过峰，改变洗脱缓冲液PBS的pH值为8.0，出现一个很小的尖峰，称为洗脱峰1，再在此碱性缓冲液中加入0.5m NaCl，又得到洗脱峰2，层析图见图1.将三部分蛋白，分别对水透析、脱盐、冻干，加入pH 6.8的0.02mol/L PBS溶解，测定活性.

1、皮抑素G1活性测定方法

(1)采用待试样品对人表皮永生细胞株(HaCat)细胞生长的抑制百分率表示活性。HaCat细胞由上海复祥生物技术有限公司提供。

(2)测定方法：将HaCat细胞在含10％胎牛血清的RPMI1640培养液中，在5％CO₂培养箱中37℃培养至对数生长期，用0.25％胰酶从培养瓶壁上消化10分钟左右，振动培养瓶，收集细胞，离心洗去酶液，用培养液配成3×10⁴/ml细胞悬液，加入96孔培养板中，每孔加160μL细胞悬液，在CO₂培养箱中培养24小时后，加入待测样品40μL，待测样品的配制：样品除菌后测定蛋白浓度，用培养液配成2.5μg/ml浓度(100ng/40μL)并作17次倍比稀释，每种浓度在每孔中加入40μL，共三个平行孔，对照组加40μL培养液，设6个平行孔，96孔板四周36个孔，因误差较大，一般只加200μL Hank’s液,不参与实验，加样后96孔板在CO₂培养箱中继续培养72小时，每孔中加入20μL 5mg/ml的MTT，继续培养4小时后，倾去上清，每孔加入100μL二甲基亚砜，溶液显蓝紫色，在酶标仪OD 492nm处读数，以3个平行样品孔的平均OD值与6个对照孔的平均OD值，计算抑制百分比。