[发明专利]一种组织透明化液SUT及其制备和应用

说明书

本发明实施例涉及一种组织透明化液SUT，所述组织透明化液SUT主要由SDS和尿素及TritonX‑100构成。本发明还涉及该组织透明化液SUT制备及其应用。本发明实施例提供的组织透明化液SUT降低了透明化液配制的成本及难度，增加了透明化效果，其对心肌的透明化程度优于部分现有透明化液配方。

技术领域

本发明涉及一种组织透明化液SUT及其制备和应用。

背景技术

在单细胞分辨率水平获取可视化的、完整的组织结构信息是科学家们一直以来的梦想。通过对完整组织进行单细胞分辨率成像，可以获得完整组织的三维立体图像，借此可以在器官和系统水平阐明细胞间连接方式及其动态变化，这将会大大提高我们对疾病发生发展过程的认识，因为疾病中单细胞事件最终会导致整个机体健康状况的改变。但组织器官的不透光性成为实现这一梦想的最大阻碍。

经典的蛋白定性定量(即确定是哪种蛋白，确定某种蛋白的含量多少)技术包括western blot、免疫组化、免疫荧光等，其中(1)western blot通过电泳技术将各种蛋白分隔开来，能对蛋白进行基本的定性定量，但无法确定蛋白在组织中的空间分布位置，更无法获取组织内蛋白分布的三维立体图像；(2)由于组织器官的不透光性，传统的免疫组化与免疫荧光是针对组织切片(包括石蜡切片和冰冻切片)进行,切片厚度<8μm，才利于光线透过及荧光染料的穿透。其中免疫组化得到的是二维图片，无法分析蛋白在组织中的三维立体分布；免疫荧光可以通过对组织孵育荧光染料，然后用共聚焦显微镜进行三维重构，得到蛋白分布的三维立体图像，但传统免疫荧光重构的厚度受切片厚度的限制，得到的三维图像厚度太小(<8μm)，对一些较大的细胞(如左室心肌细胞，直径10～15μm)则无法显示全貌，而且，如果组织切片太厚，荧光染料(如荧光抗体)则无法穿透组织进行蛋白标记，且共聚焦显微镜的发射光也无法穿透组织全层，因此三维重构在应用上有很大的局限，目前多用于拍摄荧光二维图片。

由于组织器官的不透光性和传统研究技术的种种局限，我们无法获得完整组织中的蛋白分布情况，试想，如果有一种方法能够使组织拥有足够大的光透过度，从而使共聚焦显微镜的发射光能够穿透组织全层，且通过对组织进行特定处理使得荧光染料也能够穿透组织全层，那么，对较厚的完整组织的单细胞分辨率成像以及获取蛋白在完整组织中的时间空间分布即可实现，这将对揭开生命的奥秘提供一种新的路径，大大提高我们对生命体的认识，同时将会大大提高我们对疾病发生发展过程的认识，促进人类的健康事业。

影响组织光透过度的因素有两个：(1)光散射--主要因为不同组织结构层间折射率的差异，其中脂质成分影响最大；(2)光吸收--主要由于内源性生色基团，其中血红蛋白和肌红蛋白占主导。那么提高组织光透过率也相应的有两个途径：(1)尽可能减少不同组织结构层间折射率的差异，尽可能除尽脂质；(2)尽可能除尽组织中的血液及肌红蛋白。

组织透明化首先通过多聚甲醛固定组织蛋白、再与丙烯酰胺交联形成组织凝胶复合物，组织凝胶复合物有两个特点：(1)这种复合物可以将蛋白及核酸固定在原位，并可代替脂质，成为构架起细胞的支撑性结构，因而在后续的透明化液清洗过程中可以减少蛋白的丢失；(2)组织凝胶复合物是带有不同大小孔径的，荧光染料可以通过小孔进入组织内部，与目标蛋白结合，因此能够标记较厚的组织，克服传统免疫荧光的缺点。形成组织凝胶复合物后，再通过透明化液清洗组织，除去脂质和内源性生色基团，从而极大的提高组织的光透过度，通过对透明组织孵育抗体及荧光染料、共聚焦成像及3D重构，得到完整组织结构单细胞分辨率水平的可视化信息。