[发明专利]一种寡雄腐霉原生质体的制备和再生方法与复合酶解液

说明书

技术领域

本发明涉及一种微生物原生质体制备和再生方法，具体的说是一种关于生防真菌寡雄腐霉原生质体的制备和再生方法。本发明还涉及一种用于制备寡雄腐霉原生质体的复合酶解液。

技术背景

寡雄腐霉属于卵菌门腐霉科腐霉属，是一种土壤习居型腐生菌，其能够在多种重要的农作物根围定殖，对植物和动物都没有毒性，对环境安全。寡雄腐霉的菌丝可以寄生于病原菌体内，干扰寄主的代谢活动，消耗细胞内的养分，造成病菌死亡，同时，还能合成色胺，色氨酸，吲哚乙酸等生长活性物质，促进植物生理代谢，养分吸收和生长发育。寡雄腐霉不仅对多数致病真菌有很强的寄生或拮抗作用，并且能诱导农作物产生系统抗性，是一种非常有应用价值的生防真菌。对其进行更进一步的研究利用，特别是从分子水平对其进行功能基因、遗传性状改造等研究势在必行。

原生质体是指完整细胞剥除细胞壁结构后所形成的裸露细胞，为球状单细胞，易于摄取外源大分子、细胞器及细菌和病毒，是真菌遗传转化和功能研究的重要工具。制备原生质体可为该类真菌进行分子标记，以及目的基因标记与克隆提供基础实验材料。

真菌具有复杂的细胞壁成分，不同菌种，甚至同一菌种不同菌株的细胞壁成分也有差异，其原生质体制备和再生需要的条件也不一样。有效去除细胞壁的同时还要维持原生质体渗透压平衡，选择适宜的渗透压稳定剂是原生质体成活的保障。高效稳定的再生条件是原生质体恢复生长的唯一途径，现有报道中采用的再生方式几乎都是固体培养再生，可是寡雄腐霉原生质体无法在固体再生培养基中恢复生长，这就需要摸索适宜寡雄腐霉原生质体再生的方法。目前国内外鲜见关于寡雄腐霉原生质体制备方法的报道，要想对这种非常有应用价值的生防真菌寡雄腐霉从分子水平进行进一步研究利用，就需要摸索出一套适用于寡雄腐霉原生质体制备及再生的方法用于后期研究应用。

不同菌株的细胞壁成分差异显著，因而在制备原生质体时用于去除细胞壁的复合酶解液也是千差万别的，目前尚未有寡雄腐霉专用复合酶解液，其余菌株所使用的复合酶解液不能去除寡雄腐霉的细胞壁，因而无法完成寡雄腐霉原生质体的制备。

发明内容

本发明的目的是针对上述问题，提供一种寡雄腐霉原生质体制备及再生的方法，经该方法得到的原生质体可用于从分子水平上进行寡雄腐霉基因功能、基因改造等相关基因遗传转化的研究应用，本发明的第二目的是提供一种寡雄腐霉专用的高效复合酶解液体系，用于酶解寡雄腐霉菌丝孢子混合体。

本发明的内容，一是提供一种优化简便的制备寡雄腐霉原生质体的方法，具体步骤如下：

（1）菌丝体制备：将寡雄腐霉菌丝接种在PDA平板培养基上，26℃，培养3～5d，将平板上的菌丝孢子混合体全部刮下来，用渗透压稳定剂洗涤，离心收集寡雄腐霉菌丝孢子混合体；

（2）原生质体制备：向收集到的寡雄腐霉菌丝孢子混合体中，加入复合酶解液，充分溶解进行酶解，获得寡雄腐霉原生质体；

（3）原生质体纯化：上述获得的寡雄腐霉原生质体与菌丝孢子的混合物，过滤除去未被酶解的菌丝与孢子体；离心收集纯化后的寡雄腐霉原生质体。

作为优选，所述渗透压稳定剂为：0.6～0.8 mol/L甘露醇溶液，25 mmol/L CaCl₂和10 mmol/L Tris-HCl， pH值为7.5。

作为优选，离心收集寡雄腐霉菌丝孢子混合体的条件为：5500rpm，室温离心10min。

作为优选，复合酶解液体系为：针对每1g寡雄腐霉菌丝孢子混合体，复合酶解液的配方为， 0～6mL 1% lysing enzyme，0～6mL 1% cellulase和50～200 U lyticase，且lysing enzyme与cellulase的含量不能同时为0。

作为优选的，复合酶解液酶解寡雄腐霉菌丝孢子混合体的酶解条件为：30℃，80rmp,酶解2～3h。

作为优选的，离心收集纯化寡雄腐霉原生质体的条件为：5500rpm，室温离心10min。

本发明的内容二是提供一种有效的寡雄腐霉原生质体的再生培养途径，具体步骤如下：用前述的渗透压稳定剂洗涤重悬寡雄腐霉原生质体，并将原生质体浓度稀释到10⁸个/mL；将纯化稀释后的寡雄腐霉原生质体在液体再生培养基中26℃，80rpm，液体振荡培养2～4d。