[发明专利]一种实时荧光PCR检测草贝母和轮叶贝母成分的方法

说明书

本发明提供了一种快速检测草贝母和轮叶贝母成分的方法，涉及一种实时荧光PCR法检测草贝母和轮叶贝母成分的引物、探针及具体检测方法，具有良好的灵敏性和特异性，可用于草贝母和轮叶贝母成分的鉴定，对于加强中药质量的管理，促进中药现代化发展方面具有重大意义。

技术领域：

本发明属生物检测技术领域，涉及中药成分的检测方法，具体涉及检测草贝母和轮叶贝母成分的引物、探针以及检测方法。

背景技术

贝母为多年生草本植物，其鳞茎供药用，因其形状得名，《本草经集注》说：“形似聚贝子”，故名贝母，能止咳化痰、清热散结之功。川贝母(Fritillaria cirrhosa)是贝母中的珍品，是百合科多年生草本植物乌花贝母、卷叶贝母、罗氏贝母、甘肃贝母、梭砂贝母等贝母的地下鳞茎。因主产于四川而得名，但在西藏、甘肃、新疆、华北、东北均有出产。川贝母性微寒而味甘苦，止咳化痰之效较强，入心肺经，功能润肺，临床常与沙参、麦冬、天冬、桑叶、菊花等配伍用于热痰、燥痰、肺虚劳嗽、久嗽、痰少咽燥、痰中带血以及心胸郁结、肺痿、肺痈等病症的治疗。现代药理研究证实，川贝母含有川贝母碱等多种生物碱，川贝母碱有降低血压，兴奋子宫等多种药理作用。

因为川贝母在贝母中药效最好且无法人工种植，导致川贝价格一直居高不下，而贝母类药材来源较多，致使一些人用其他与川贝母外观相似的贝母冒充川贝母销售，导致市场上出现了众多的混淆品和伪品，其中主要以浙贝母(Fritillaria thunbergii)、草贝母(Iphigenia indica)和轮叶贝母(Fritillaria maximowiczii)为主。

草贝母为百合科科植物山慈姑的鳞茎，含秋水仙碱、异秋水仙碱等多种生物碱。因秋水仙碱可在人体内被氧化为二秋水仙碱，有剧毒，对消化系统、泌尿系统均可产生严重的刺激症状，误食可产生严重的腹痛、频繁的恶心、呕吐和腹泻等不良影响，同时也对神经系统有抑制作用，能降低体温，使触觉迟钝，并发生上行性麻痹，如累及膈肌，则可引起呼吸运动障碍，可因呼吸衰竭而死亡。有报道误食草贝母死亡的案例(昆明医学院学报，2007，(2B)：274-274)。轮叶贝母，又名一轮贝母，其植株通常具一轮叶，顶端具一朵花，果实与川贝母相似，也具有一定毒性。

对川贝母的鉴别，目前主要还是通过品种外观进行区分，但是贝母间很多品种外观非常相似，利用常规的外观鉴定方法很难将它们进行区分，当药材加工成粉末或其他产品时就更加难以鉴定。利用PCR从基因水平对品种进行鉴定可以解决这个难题，但是现在仅个别贝母品种有PCR鉴别的方法。《中国药典》中川贝母鉴定使用了聚合酶链式反应-限制性内切酶长度多态性方法(《中国药典2015年版》一部上册第37页)，通过使用川贝母鉴定引物对供试品进行常规PCR检测，然后将PCR产物经Sma I酶切后进行电泳检测，在供试品凝胶电泳图谱中，与对照药材凝胶电泳图谱相应的位置上，在100～250bp有两条DNA条带可证明样品为川贝母。专利“浙贝母PCR鉴定试剂盒及鉴定方法”(申请号：CN201210350761.0)则提供了一种使用常规PCR对浙贝母成分进行检测的方法。

目前，对于川贝母中易掺假且有毒性的草贝母和轮叶贝母还没有快速准确的检测方法，本领域迫切需要开发新的快速简便地检测草贝母和轮叶贝母成分的技术。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供了一种实时荧光PCR检测草贝母和轮叶贝母成分的引物探针及检测方法。

根据草贝母rbcl基因和轮叶贝母ITS2基因的设计特异检测引物和探针。

实时荧光PCR检测草贝母源性成分的引物探针，分别为：

上游引物P1：CCAGTCTTGATCGTTACAAAGG

下游引物P2：GAACCTTCTTCAAAAAGGTCTAAAGG

带有荧光染料的探针序列为：AGCATCGAGAAAGTTATTGGGGAAGAAAATCA