[发明专利]一种脱细胞角膜的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于医疗材料的制备技术领域，具体涉及一种脱细胞角膜的制备方法。

背景技术

角膜病是我国第二大致盲性眼病，我国现有约400万角膜盲患者，每年角膜盲病人新增约10万余人，但目前国内每年仅能实现大约5000-8000例角膜移植手术。角膜供体严重不足的现实国情，导致绝大多数角膜盲患者在黑暗中排队等待，有的甚至错过最佳治疗机会，导致永久失明。角膜移植分为穿透性角膜移植、板层角膜移植和角膜内皮移植。其中板层角膜移植对供体材料的要求较低，适合于角膜内皮无明显病变的所有患者，板层角膜移植约占角膜移植总算的1/2，如解决了板层角膜移植的供体角膜材料，就解决了我国一半的角膜病盲人的手术复明问题。近年来，随着生物组织工程学的广泛和深入研究，脱细胞处理和病毒灭活等工艺制备的异种角膜基质材料在动物水平和临床应用中取得了初步的治疗效果，但角膜基质经脱细胞后，存在透明度差，部分力学结构破坏所致的抵抗力下降、厚度逐渐变薄等问题仍没有很好解决，故应用脱细胞基质的角膜在临床上仍不能替代人的角膜，没有解决我国角膜供体材料严重匮乏的问题，故优化脱角膜基质细胞的工艺，使经过脱细胞的角膜能保持透明和力学结构是目前研究的热点，也是为我国角膜盲患者重建光明带来的希望。

以往报道的角膜脱细胞方法多使用基本缓冲液，如PBS、HBSS、细胞培养液等对角膜进行溶胀，通过物理、化学或生物学方法将细胞破碎后进行洗脱，短时间处理不能有效清除细胞成分，一般需要24-72小时的脱细胞过程，当长时间处理往往会导致角膜有序胶原结构的破坏，伴随着角膜透明性丧失，光学效果差，达不到临床复明的手术要求。虽然经过甘油脱水后可再次恢复透明，但移植后会逐渐变薄或长期不透明，不能达到长期复明的目的。针对上述问题，研发新型的脱细胞角膜制备方法，避免因物理、化学和生物学等处理对角膜胶原纤维结构造成的破坏，使脱细胞后的角膜保持透明和应用的力学特性是目前亟待解决的问题。

发明内容

本发明的目的是为了避免现有技术存在的缺点，提供一种始终保持角膜透明特性的脱细胞方法，制备过程中保持角膜胶原结构和透明度，避免现有方法对角膜胶原结构和透明性的影响。

为实现上述目的，本发明在于整个脱细胞过程使用一种角膜保护剂，维持角膜的正常厚度和透明性；采用静高压技术破碎细胞，避免角膜溶胀破坏角膜基质的显微结构；脱细胞处理采用去垢剂复合核酸酶联合作用有效去除细胞核成分，最后漂洗去除脱细胞用试剂和细胞碎片；在脱细胞步骤保持合适的压力条件、去垢剂、消化酶浓度和处理时间，最终实现脱细胞处理后的角膜保持其原有的透明度和有序的角膜基质显微结构。

本发明的方法，包括如下的步骤：

1)将角膜板层置于保护液中，并置于容器中密封；

2)采用高静压处理破碎细胞；

3)将角膜取出后，置于添加了去垢剂和核酸酶的保护剂中进行震荡脱细胞处理；

4)将脱细胞后的角膜置于保护剂中漂洗2小时以上完成制备。

所述的脱细胞角膜制备用保护液，是添加有5-12g/L透明质酸、5～20g/L硫酸软骨素、3～10g/L低分子量右旋糖酐的PBS或HBSS缓冲液；

上述的脱细胞角膜保护液，其pH值调至7.2～7.4；

上述的脱细胞角膜保护液，其渗透压为300-400mOsm

作为优选，本发明的脱细胞角膜保护液中还添加有妥布霉素，其添加量优选为1-3ml/L。

进一步的，步骤2)中高静压处理破碎细胞的条件为200-600MP，时间不超过10分钟；

步骤3)中的去垢剂为十二烷基硫酸钠，浓度为0.1-0.5％，消化酶为DNase I，浓度为500-2000U/ml，

脱细胞处理的条件如下：温度20-30℃，时间2小时。

本发明的方法使用的保护液通过组分与配比的选择使制备的保护液能维持脱细胞角膜制备液体的胶体渗透压，与传统的脱细胞角膜制备液体相比，可以显著降低胶原等细胞外基质成分在后期脱细胞处理过程中过度溶胀、丢失导致的角膜透明度下降；而且添加妥布霉素等抗生素成分，抑制易感染角膜的细菌滋生，如绿脓杆菌、克雷白杆菌、肠杆菌属、变形杆菌等，避免处理过程中的污染几率。在破碎细胞的同时，避免长时间高压对角膜基质胶原破坏引起的透明度下降。其次，去垢剂和核酸酶同时作用，更快速有效地去除细胞碎片和核酸成分，避免去垢剂和其他成分长时间处理对角膜胶原等蛋白成分破坏引起的角膜透明性下降。

具体实施方式