[发明专利]生物补片的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于组织工程技术领域，具体为新型的肌腱和小肠浆膜组织补片的制备方法。

背景技术

神经、膀胱、血管、肌腱、腹壁及眼的结膜等组织缺损的修复中最大的难题是修复材料。目前国内外用外科补片的材料绝大部分是合成材料，如聚丙烯补片(PP)和聚酯补片(PE)等。其最大的缺陷是抗感染率低，组织相容性差，及物理刺激引起的无菌炎症和慢性排异引起的后遗症，甚至造成修补的器官发生感染和与周围组织发生粘连。近几年发展的半吸收复合材料，如聚羟基乙酸(PGA)和聚乳酸(PLA)等，常因降解过快导致失去疗效。而使用合成材料和复合材料可能导致诸多临床并发症，均不是理想的组织修补材料。随着生物材料的出现——寻找具有良好组织屏障作用和抗感染能力强的低细胞毒性、低抗原性的生物材料应用于临床迫在眉睫。

肌腱和小肠的浆膜是一种天然的细胞外基质生物材料，主要由I、III型纤维胶原蛋白构成，并具有弹性结缔组织复杂的成分结构，是理想的生物支架材料。另外，小肠的浆膜中还含有多种生长因子，即使经过脱细胞处理后依然保留，这些生长因子在组织的修复和重构中有着重要的促进作用，优于目前临床应用的其它细胞外基质材料和人工聚合物。

国外已经有多种商品化的小肠脱细胞产品，如Surgisis，Restore等产品；在我国也有相关专利如“脱细胞小肠粘膜下层生物材料”(申请号200810150792.5)和“一种脱细胞生物补片及其制备方法和装置”(申请号201310117569.1)等，这些产品的问题在于脱细胞方法不完善，例如处理方法仅使用低浓度过氧乙酸处理，细胞残留较多，脱细胞效果欠佳，使用中会引发机体的免疫排斥反应；或加用乙醇等进行脱细胞；或应用长时间浸泡；或采用超声、反复冻融、核酸酶进行脱细胞处理，这些处理造成被脱组织结构和蛋白质活性破坏，使得脱细胞肌腱和小肠组织材料内所包含的生长因子不能发挥作用。

因此针对现有技术的不足，本发明采用高静压技术联合少量的酶和去垢剂脱除细胞核，并全程应用保护液进行保护的方法，提供了两种既降低了组织的免疫原性，又保留了其正常胶原结构的优质生物补片。

发明内容

本发明提供了一种快速、全程使用特殊保护液以及适宜高效的物理联合复合生物酶制备肌腱和小肠浆膜的脱细胞支架以用作生物补片的方法。

本发明的创新处在于：1、肌腱和小肠浆膜的脱细胞过程中全程使用一种肌腱和小肠浆膜结构的保护液；2、采用高静压技术预分离肌腱和小肠浆膜组织内的细胞；3、采用复合核酸酶方法消化残余细胞核；4、利用去垢剂脱除松散破碎细胞片；5、使用保护液进行漂洗。脱细胞步骤设定合适的温度、时间以及去垢剂、消化酶浓度对肌腱和小肠浆膜组织进行处理。

保护液的成分为：DMEM细胞培养基粉末5-10g/L、L-组氨酸盐酸盐2.87-3.83g/L、硫酸软骨素25-30g/L、低分子右旋糖酐20-35g/L、羟丙基甲基纤维素2-8g/L、别嘌呤醇0.5-0.8g/L、 HEPES缓冲液20-25ml/L、盐酸地塞米松1-2mg/L、还原型谷胱苷肽1.5-3g/L以及左氧氟沙星0.1-0.2g/L。

调节保护液的ph值为7.2-8.0，渗透压为300-400mOsm/kgH2O。

高静压压力条件为200-400MP，高静压频率为2-5次，每次为1-2分钟。

DNA酶的浓度为100-10000U/ml，核酸酶的浓度为100-10000U/ml。DNA酶或核酸酶的脱细胞核时间为1-4小时，处理温度为15-30度。

去垢剂条件浓度为0.5-8％的TritonX-100，去垢剂使用时间为1-4小时。

可选择性的同时或分开进行酶和去垢剂的处理。

在保护液中漂洗0.5-4小时。

将制备的肌腱和小肠浆膜补片贴附在硝酸纤维素膜上，放入无水氯化钙分子筛内脱水，经装袋密封并标记，后经钴60照射灭菌，以4℃保存备用；

在临床使用前将保存的肌腱和小肠浆膜补片放入4000u的妥布霉素生理盐水溶液浸泡10 分钟。

附图说明

图1为小肠的结构说明图，最下层为本发明所采用的小肠浆膜

图2为正常兔小肠的切片HE染色，最上层为浆膜层

图3为兔小肠浆膜脱细胞切片DAPI染色

图4为正常猪肌腱切片HE染色

图5为脱细胞猪肌腱切片HE染色

具体实施方式