[发明专利]一种四价流感病毒亚单位疫苗及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种四价流感病毒亚单位疫苗及其制备方法。

背景技术

流感是由流感病毒引起的，可造成大规模流行的人、禽畜共患的急性呼吸道传播疾病。流行性感冒病毒分甲、乙、丙三型。其中，甲型致病力最强，可感染动物和人类并引起流行甚至是世界范围内的大流行；乙型致病力稍弱，可引起局部流行。流感病毒经常发生抗原漂移和抗原转移，逃避机体免疫系统的防御，这也是造成大流行的原因。流感病毒具有高度传染性，通过飞沫经空气传播。经短暂潜伏期后，急起高热寒战，1~2日内体温可高达40℃，伴随全身乏力、头痛、肌痛、咽痛等症状，可引发肺炎、支气管炎、心肌炎、心包炎等并发症，造成老年人、体弱者等高危人群的大量死亡，给社会带来巨大的损失。最大规模的流感大流行发生于1918~1919年，造成2100~4000万人死亡（其中美国就有50万人，仅1918年10月就有19.6万人死亡），超过第一次世界大战的战争死亡人数。因此，流感的预防一直受到世界各国的高度重视。临床上对流感仍缺乏有效的治疗药物，接种流感疫苗是唯一有效预防手段。

市场上现有疫苗为流感全病毒灭活疫苗和流感病毒裂解疫苗，传统裂解疫苗纯化方法为：澄清灭活的单价收获液经超滤浓缩、蔗糖密度区带离心法纯化、超滤除去蔗糖、裂解、再次蔗糖密度区带离心法纯化，再次超滤除去蔗糖，除菌过滤，加入硫柳汞作为防腐剂。工艺复杂，步骤繁琐，消耗大量的人力物力，增加微生物污染风险。

同时传统流感疫苗纯度不够且含有对人体有害的佐剂及防腐剂。佐剂虽然可以改善疫苗的免疫应答，但代价是反应原性增加，甚至很严重。例如，老年人接种MF59佐剂流感疫苗后抗体水平提高了，但是接种后的局部反应更多了，在一项老年人的对照研究中，接种含佐剂疫苗的老年人与接种无佐剂的老年人相比，疼痛增加6倍，局部发红增加2倍，乏力和肌肉痛等全身反应也增加了。另据报道，使用了丹麦Statens血清研究所生产的氢氧化铝吸附的百白破疫苗，导致546例注射部位出现顽固性硬结性瘙痒的严重不良反应。其中77%的不良反应病例经皮肤试验确认为对氢氧化铝过敏。目前，国家食品药品管理局已禁止了氢氧化铝佐剂用于狂犬病疫苗的生产。硫柳汞一直被用做许多疫苗的防腐剂，不过现在硫柳汞引起接触性皮炎、变应性结膜炎、耳毒性等毒副作用已经开始引起科研人员的重视，现在已经在美国爱荷华州、加利福尼亚州、英国和其他欧洲国家所禁止在儿童疫苗中使用硫柳汞。

发明内容

针对上述的背景下，本发明目的在于公开一种四价流感病毒亚单位疫苗及其制备方法，其特征在于所述四价流感病毒亚单位疫苗采用裂解剂和新的制备方法，将鸡胚尿囊收获液中流感病毒裂解后的蛋白进一步纯化，制成流感病毒亚单位疫苗，其中每剂含甲1（H1N1）、甲3（H3N2）和2种乙（B）型共四种流感血凝素含量在80%以上。

一种四价流感病毒亚单位疫苗制备方法，其特征在于依次包括以下步骤：（1）病毒接种：将甲1（H1N1）、甲3（H3N2）和2种乙（B）型流感病毒工作种子分别接种于9~11 日龄健康鸡胚尿囊腔中；

（2）病毒增殖培养：将接种后的鸡胚转入33~35℃孵箱培养48~72小时，增殖流感病毒；

（3）尿囊液收获：筛选活鸡胚，放置2~8℃冷胚10~24小时后收获尿囊液；

（4）澄清：用离心法或者过滤法除去鸡胚血红细胞等大部分杂质；

（5）灭活：单价病毒收获液中加入终浓度不高于200mg/ml的甲醛，于2~8℃灭活40~120小时，此步骤也可在超滤浓缩后进行；

（6）超滤浓缩：将充分灭活后的流感病毒尿囊收获液，用截留分子量300~1000kD 的超滤膜进行超滤浓缩；

（7）裂解和超速离心纯化：将超滤浓缩液加入裂解剂，混匀上样，经蔗糖密度区带离心纯化，根据一定的蔗糖浓度收获裂解液；

（8）凝胶过滤层析纯化或超滤：将上一步蔗糖密度梯度离心得到的溶液经凝胶过滤层析系统进一步纯化或者超滤得到流感病毒亚单位疫苗单价原液；

（9）混配：将甲1（H1N1）、甲3（H3N2）和2种乙（B）型流感病毒单价原液按照血凝素浓度1：1：1：1的关系进行混配，各型病毒血凝素浓度控制在40~48mg/ml之间；

（10）过滤除菌：将上一步混配后的病毒液经0.22mm滤膜过滤除菌后即得到流感病毒亚单位疫苗半成品；

（11）分装：将疫苗半成品分装到预灌封注射器或者西林瓶中，每支0.5ml，每1次人用剂量为0.5ml，含各流感病毒株血凝素应在10~20mg范围；