[发明专利]一种四价流感病毒亚单位疫苗及其制备方法

权利要求书

1.一种四价流感病毒亚单位疫苗及其制备方法，其特征在于所述四价流感病毒亚单位疫苗采用一步法同时进行裂解和分离亚单位组分血凝素，裂解剂为新型裂解剂壬苯醇醚-9，将鸡胚尿囊收获液中流感病毒裂解后的蛋白进一步纯化，制成流感病毒亚单位疫苗，每剂含甲1型（H1N1）、甲3型（H3N2）、2种乙型共四种流感血凝素含量在80%以上，不含佐剂，不含硫柳汞等防腐剂。

2.一种四价流感病毒亚单位疫苗制备方法，其特征在于依次包括以下步骤：

病毒接种：将甲1（H1N1）、甲3（H3N2）和2种乙（B）型流感病毒工作种子分别接种于9~11 日龄健康鸡胚尿囊腔中；

病毒增殖培养：将接种后的鸡胚转入33~35℃孵箱培养48~72小时，增殖流感病毒；

尿囊液收获：筛选活鸡胚，放置2~8℃冷胚10~24小时后收获尿囊液；

澄清：用离心法或者过滤法除去鸡胚血红细胞等大部分杂质；

灭活：单价病毒收获液中加入终浓度不高于200mg/ml的甲醛，于2~8℃灭活40~120小时，此步骤也可在超滤浓缩后进行；

超滤浓缩：将充分灭活后的流感病毒尿囊收获液，用截留分子量300~1000kD 的超滤膜进行超滤浓缩；

裂解和超速离心纯化：将超滤浓缩液加入裂解剂，混匀上样，经蔗糖密度区带离心纯化，根据一定的蔗糖浓度收获裂解液；

凝胶过滤层析纯化或超滤：将上一步蔗糖密度梯度离心得到的溶液经凝胶过滤层析系统进一步纯化或者超滤得到流感病毒亚单位疫苗单价原液；

混配：将甲1（H1N1）、甲3（H3N2）和2种乙（B）型流感病毒单价原液按照血凝素浓度1：1：1：1的关系进行混配，各型病毒血凝素浓度控制在40~48mg/ml之间；

过滤除菌：将上一步混配后的病毒液经0.22mm滤膜过滤除菌后即得到流感病毒亚单位疫苗半成品；

分装：将疫苗半成品分装到预灌封注射器或者西林瓶中，每支0.5ml，每1次人用剂量为0.5ml，含各流感病毒株血凝素应在10~20mg范围；

包装：灯检合格后，按照质量标准进行贴标装盒等包装。

3.根据权利要求1~2所述的一种四价流感病毒亚单位疫苗及其制备方法，其特征在于所述裂解剂为壬苯醇醚-9（Nonylphenyl Polyethylene Glycol Ether）。

4.根据权利要求2所述的一种四价流感病毒亚单位疫苗及其制备方法，其特征在于所述裂解和超速离心纯化同步进行，更详细的做法为在超滤浓缩液中加入裂解剂中并使其混合均匀，混合均匀后进行上样，在蔗糖密度区带离心的过程中进行同步裂解，以达到边裂解边分离的目的，裂解完成后根据一定的蔗糖浓度收获裂解液。

5.根据权利要求1所述的一种四价流感病毒亚单位疫苗及其制备方法，其特征在于所述凝胶过滤层析系统为Sephadex G-25葡聚糖凝胶。

6.根据权利要求1所述的一种四价流感病毒亚单位疫苗及其制备方法，其特征在于所述新的流感病毒亚单位疫苗，本疫苗不含CpG ODN 佐剂或氢氧化铝等佐剂。

7.根据权利要求1所述的新的一种四价流感病毒亚单位疫苗及其制备方法，其特征在于所述流感病毒亚单位疫苗，本疫苗不含硫柳汞等防腐剂。

8.根据权利要求4所述的一种四价流感病毒亚单位疫苗及其制备方法，其特征在于所述裂解剂使用浓度为0.01~2%，优选浓度为0.1~1.5%。

9.根据权利要求4所述的一种四价流感病毒亚单位疫苗及其制备方法，其特征在于所述收获液蔗糖浓度为10~40%，优选浓度为15~30%。

10.根据权利要求4所述的一种四价流感病毒亚单位疫苗及其制备方法，其特征在于所述区带离心时间为1~24小时，优选为4~16小时。