[发明专利]一种通过检测焦磷酸电荷的基因测序方法

说明书

技术领域

本发明属于基因测序领域，具体涉及一种通过检测焦磷酸电荷的基因测序方法。

技术背景

快速和准确地获取生物体的遗传信息对于生命科学研究一直具有十分重要的意义。对于每个生物体来说，基因组包含了整个生物体的遗传信息。测序技术能够真实地反映基因组DNA上的遗传信息，进而比较全面地揭示基因组的复杂性和多样性，因而在生命科学研究中扮演了十分重要的角色。

测序技术最早可以追溯到20世纪50年代，早在1954年就已经出现了关于早期测序技术的报导，即Whitfeld等用化学降解的方法测定多聚核糖核苷酸序列；1977年Sanger等发明的双脱氧核苷酸末端终止法(Sanger基因测序法)和Gilbert等发明的化学降解法，标志着第一代测序技术的诞生；此后在三十几年的发展中陆续产生了第二代测序技术，包括Roche公司的454技术、Illumina公司的Solexa技术和ABI公司的SOLiD技术；近几年，Helicos公司的单分子测序技术、Pacific Biosciences公司的单分子实时(Single Molecule Real Time,SMRT)测序技术和Oxford Nanopore Technologies公司正在研究的纳米孔单分子测序技术被认为是第三代测序技术；同时以Illumina为代表的第二代测序技术及美国Ion Torrent公司开发的半导体基因测序技术持续取得突破，发展出新一代基因测序技术(NGS)。通过大规模传感器阵列实现高通量并行测序，极大降低了基因测序价格及测序时间，并将准确度提高到99％以上，测序技术正向着高通量、低成本、高准确率的方向发展。

但是，目前的测序方法存在诸多问题。第一代测序技术成本高，据估算，用该方法完成人类基因组计划，需花30亿美元；数据分析量大；自动化程度不高或需手工操作；一些聚合酶链式反应(PCR)产物不能被分析而需制备单克隆；且该法速度慢，测序时间长，据估算，用该法完成人类基因组的测序，至少需用时3年。第二代测序相对而言，工作量仍然比较大，费用仍然比较高，不适合用于序列已知的单基因的突变检测；关键在于读长比较短，时间还不够快，所需模板用量还比较多，故无法在单细胞、单分子水平进行检测。第三代测序技术适用于起始量少、需要高通量、自动化程度很高的全基因组测定，因此对于要求不高的单个基因位点的检测如单基因病等的基因诊断反而不适用，即性价比反而降低；此外，第三代测序技术仍需要致力于背景噪音的减少，提高准确率，及降低测序费用；另外，在DNA的固定方面如何保持DNA的延展性而不出现二聚体结构，也有待解决和完善的地方。新一代测序技术，比如Ion Torrent公司的半导体测序技术，由于采用了半导体离子敏感场效应传感器，可以借助半导体工业的摩尔定律持续减小传感器尺寸，增加阵列规模，提高测序的通量，降低费用；但是，新一代基因测序面临的主要挑战之一是如何提高随着传感器越来越小而大幅降低的信噪比并保持高准确性。

发明内容

1、发明要解决的技术问题

在Sanger基因测序基本法的框架下，在碱基延伸反应过程中，当DNA聚合酶在每一个DNA模板链上滑动，合成链每掺入一个核苷酸(dNTP)，就会释放出一个氢离子和一个焦磷酸。传统的离子流Ion Torrent半导体测序中的离子敏感场效应晶体管ISFET就会检测到释放出的氢离子引起的溶液pH值变化，并将其转化为电信号，进一步翻译为对应的碱基。但是因为氢离子的相对分子质量只有1，所以扩散速率比较快，电信号时间较短，造成检测的准确率较低；且氢离子只带有一个正电荷，离子敏感场效应管能检测到的有效氢离子数量较低，电信号较弱，所以检测的信噪比较低，对检测的准确率影响较大。本发明针对现有技术面临的低信噪比、低准确率的技术挑战，提出了一种通过检测焦磷酸电荷的高信噪比基因测序方法，该方法实现了基因测序的高通量、低成本和高准确率。

2、技术方案

为达此目的，本发明所采用的技术方案是：

一种通过检测焦磷酸电荷的基因测序方法，该方法包括以下步骤：

步骤一：将一种焦磷酸PPi受体固定在电荷敏感传感器的表面，形成焦磷酸敏感传感器；