[发明专利]L-羟脯氨酸的生物转化方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种氨基酸衍生物的制备方法，具体地指一种L-羟脯氨酸的生物转化方法。

背景技术

羟脯氨酸(Hydroxyproline，Hyp)是胶原蛋白的主要组成部分，不属于20种常见的氨基酸。近年来，L-羟脯氨酸的研究与开发已经引起医药、生化、食品及美容业等方面的广泛关注。它可以作为化妆品添加剂，具有抗氧化、抗辐射的作用；它亦具有减肥作用，可望成为比较理想的减肥药物；它还具有多种生理功能与独特的生物活性，既可作为各种软组织疾病的药物，如结缔组织受损、风湿性关节炎等，又可加快伤口愈合，以及治疗各种皮肤疾病。L-羟脯氨酸作为氨基酸注射液的重要组分，对急慢性肝病所导致的低蛋白血症有一定的疗效；它参与脂肪的乳化及红细胞血红素和球蛋白的形成，具有调节脂肪乳化等作用；它还是多种药物，如第三代抗生素、抗肿瘤、抗高血压及新型胃药等的合成原料。L-羟脯氨酸是碳青霉烯(培南类)抗生素原料合成的医药中间体，碳青霉烯类药物是迄今为止抗菌谱最广、抗菌活性较强的抗生素，随着青霉素、头孢类等传统抗生素耐药菌问题日益严峻，碳青霉烯类抗生素正扮演着抗临床重症感染最后一道防线的重要角色，市场销售量大。

现有技术中，L-羟脯氨酸的生产方法主要有发酵法、酶法、蛋白水解提取法、化学合成法；目前，实验室多采用发酵法，但是因为羟脯氨酸的结构特殊，发酵法尚不能生产；化学合成方法成本太高；所以从胶原蛋白中分离提取是一种重要途径。以蛋白质为原料经酸、碱或蛋白水解酶水解后，再分离纯化各种氨基酸的工艺过程，简称水解 法。水解法主要有酸水解法、碱水解法和酶水解法三种。碱法会引起氨基酸消旋，酶法水解的缺点是反应不完全，中间产物如肽类较多，一般时间较长，易污染菌，在氨基酸生产中很少应用，所以目前制备羟脯氨酸一般采用酸解法，反应过程如下：

这一提取路线中采用了亚硝化法，原理是利用NaNO₂在酸性条件下把α-氨基酸的氨基破坏掉，变为羟羧酸，而将亚氨酸羟脯氨酸和脯氨酸反应成为亚硝胺，加酸水解后又变为亚硝酸，从而把α-氨基酸除去，利于后续的离子交换。

也有未采用上述工艺的报道，其改进工艺是在水解液脱色之后利用各种氨基酸等电点的不同，直接离子交换分离。脱色步骤采用活性炭，离子交换树脂主要为阳离子交换树脂D61和732型，洗脱液主要有氨水和氯化铵溶液。在最终得到羟脯氨酸晶体时，还可以得到脯氨酸副产品，羟脯氨酸的得率只有4～7％，并且还有很多的具体工艺步骤仍需要完善和改进，如改进水解设备、改进水解液脱酸工艺选用中和法或离子交换法脱酸、改进脱色工艺采用可回收利用的树脂，工艺步骤可以部分合并缩减等。

公布号为CN103509813A的中国发明专利申请公开了一种利用重组大肠杆菌发酵生产L-4羟脯氨酸的方法，通过将经密码子优化后的脯氨酸-4-羟化酶基因连接在高效启动子上，在大肠杆菌中过量表达该羟化酶，在发酵培养基中以葡萄糖为碳源，并通过添加L-脯氨酸来获得L-4-羟脯氨酸。但是，该方法是单纯利用生物方法制备，产率较低，光学纯度也不高。

上个世纪80年代中期，国外加强了羟脯氨酸的开发与应用研究， 其年需量也急剧增加。而我国现在每年有大量的动物胶出口到国外用于提取羟脯氨酸和其它氨基酸，其中的一些再返销我国。

因此，研发一种产率高、低成本的L-羟脯氨酸的生物转化方法具有重要的意义。

发明内容

本发明所要解决的问题就是克服背景技术不足，提供一种L-羟脯氨酸的生物转化方法，该方法通过一种微生物/酶催化的技术，利用药物的手性前体实现高效、低成本、无污染的生物催化合成体系，而后制备L-羟脯氨酸。

含脯氨酸-4-羟化酶的工程菌全细胞的制备过程大体过程如下：

人工合成脯氨酸4-羟化酶基因(基因号：D78338.1)，基因来源于指孢囊菌。人工合成过程委托上海桑尼生物技术有限公司进行密码子优化。然后用现代分子技术手段，将合成基因克隆到pET28a上，构建出重组质粒pET28a-Hyp。进一步，对pET28a-Hyp载体的RBS区进行改造，经高通量筛选后，将转化效率高的重组质粒导入宿主BL21(DE3)实现外源表达。后续转化优化全细胞均为BL21(pET28a-Hyp)。