[发明专利]一种天然纤维素利用菌群的宏转录组RNA的提取方法

说明书

本发明公开了一种天然纤维素利用菌群的宏转录组RNA的提取方法，属于生物技术领域。所述提取方法的主要步骤如下：(1)采用Qiazol裂解液预处理收集的菌体；(2)结合珠磨匀浆破壁裂解菌体；(3)氯仿:异戊醇抽提分离RNA；(5)异丙醇沉淀获得RNA；(6)乙醇洗涤纯化RNA。本发明通过加入Qiazol裂解液结合玻璃珠混合匀浆强化细胞破壁，不仅使微生物细胞壁尽可能破碎，RNA分子完全释放，同时有效保证了过程的可重复性，进而保证了提取的宏转录组RNA片段完整性、纯度和菌群结构完整性。

技术领域

本发明涉及一种天然纤维素利用菌群的宏转录组RNA的提取方法，属于生物技术领域。

背景技术

木质纤维素是自然界中产量最大的多糖物质，广泛存在于森林、草原和农田中。其产量丰富，价格低廉，而且多以农业和工业废弃物形式存在，是理想的生物能源类物质的生产原料。研究表明，以木质纤维素为原料的生物能源生产工艺不仅能够实现农业废弃物的再利用，而且可有效避免能源生产与粮食资源间的矛盾，成为最具潜力的生物能源工业化生产途径。

然而，由于木质纤维素组成复杂、结构致密，其水解为可利用糖的过程需要多种酶系的协同作用，导致利用成本居高不下。自然界中纤维素降解细菌菌群由多种细菌长期共生而成，能够快速高效地降解积累的大量木质纤维素。其中，木质纤维素降解菌能提供极为丰富的纤维素酶系和半纤维素酶系，而非纤维素降解菌株能提供的辅助因子，帮助纤维素快速降解。近年来的研究显示，利用菌群发酵纤维素有望实现一步法纤维素生物燃料的生产，进而较大程度的降低生产成本。因此，揭示天然菌群转化木质纤维素的作用机理，成为本领域研究的重要内容。

目前，已经建立了多种研究菌群作用机理的方法。其中，宏转录组测序是相对成熟的手段之一，已成功应用在多种菌群样品的结构分析之中，包括土壤、水体等环境样品和肠道菌群、瘤胃等功能样品。但是，由于纤维素菌群的自身特点，增加了其转因组RNA的提取难度，因此，尚未建立完善的纤维素菌群的宏转录组分析技术。

影响天然纤维素菌群宏转录组提取效果的因素主要包括如下三点：第一，纤维素菌群中的菌株多通过纤维小体结构与纤维素微丝紧密结合，以“纤维素-酶-菌体”的交联形式存在于发酵液中，这种交联会显著影响菌体的破壁和转录组提取，导致获得的RNA无法真实反映菌群基因表达情况，影响菌群转录组表达功能分析的准确性；第二，菌群发酵纤维素过程中会在细胞外积累大量的代谢产物，包括有机酸、有机醇和表面活性剂在内的多种物质，这些物质会对转录组提取试剂产生一定的干扰，影响RNA的提取效果；第三，菌群既包含革兰氏阴性菌又包含革兰氏阳性菌，还存在着大量的孢子，增加了RNA提取的难度。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种天然纤维素利用菌群的宏转录组RNA的提取方法，所采取的技术方案如下：

本发明的目的在于提供一种天然纤维素利用菌群的宏转录组RNA的提取方法，该方法的步骤如下：

1)收取纤维素发酵液，在7800g下离心5min后，收集菌体；

2)向步骤1)所得菌体中加入发酵液体积8％-10％的Qiazol裂解液，并混合均匀，将混合液转移到裂解管中，利用珠磨进行匀浆处理，匀浆处理的时间为10s，转速为4M/s，循环次数为2次，在将所得匀浆液转移到二乙基焦炭酸酯(DEPC)水处理过的EP管中；

3)在向步骤2)的EP管内加入样品等体积的氯仿-异戊醇混合液，摇匀后，在室温下放置2-3min后，在4℃，15000g下离心15min；

4)向步骤3)离心所得的水相中加入等体积的异丙醇，室温放置10min后，在4℃，8000～12000g下离心10min；

5)向步骤4)离心所得上清液中加入70％体积的乙醇并混合均匀，在8000g下离心15s，取上清，重复2次，再用RNase-free的DEPC水溶解，获得宏转录组RNA。