[发明专利]一种柑橘衰退病的q-PCR引物

说明书

技术领域

本发明涉及一种柑橘衰退病毒检测引物，具体涉及一种用于q-PCR检测柑橘衰退病毒的p23基因引物序列，属于生物技术领域。

背景技术

柑橘衰退病是一种世界性的柑橘病害，对柑橘产业危害严重。果树感染柑橘衰退病后，出现树势衰退、矮化、生长缓慢、果实品质和产量低或者无果等症状。目前，生产中该病害防控主要依赖无病毒苗木种植。为保证苗木的无毒化，在生产过程中需要对柑橘衰退病进行检测。

在病毒病的检测中，q-PCR是一种常用的方法，具有灵敏度高、快速、准确的优势。然而，这些优势往往受到引物扩增效率的限制。虽然已有报道，利用ORF1，p25，p20和3’UTR基因设计的引物序列可对病毒进行检测，但是这些引物很难检测到低含量的病毒。因此，必须筛选一种高效率的柑橘衰退病毒检测引物。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，克服现有技术的不足，提供一种灵敏度较高的柑橘衰退病的q-PCR引物，通过q-PCR可以检测不同基因型的柑橘衰退病毒。

本发明解决其技术问题采用的技术方案是，一种柑橘衰退病的q-PCR引物，序列如下：上游引物p23-F：CGTGGATTGYGGTAGAAA，下游引物p23-R：CTGAGAYTGYGTATTGTT。

本发明克服现有引物检测效率低的不足，提供一种柑橘衰退病p23基因的扩增引物，通过q-PCR可以检测不同基因型的柑橘衰退病毒。

本发明将已公布的柑橘衰退病毒p23基因序列与多个自主分离病毒株系的p23基因序列进行同源分析，在保守区域处进行引物设计，序列为p23-F:5’-CGTGGATTGYGGTAGAAA-3’,R:p23-R:5’-CTGAGAYTGYGTATTGTT-3’，上、下游引物序列均为18bp。

与已报道的引物进行灵敏度比较，本发明之引物，病毒检测灵敏度，较ORF1和3’UTR基因的扩增引物提高625倍，较p25和p20基因的扩增引物提高5倍。

本发明引物根据NCBI已经公布的柑橘衰退病毒p23基因序列，与自主分离的多个p23基因序列同源比对分析后设计，通用型强，不受柑橘衰退病基因型的限制；检测灵敏度高(最低可以检测的浓度是8.2×10^-6ng/μL的cDNA)，可用于低含量病毒的检测，避免因病毒浓度低而检测失败；能够适合多种柑橘组织检测，结果稳定，提高柑橘衰退病检测效率。

附图说明

图1为p23引物对不同基因型柑橘衰退病毒的q-PCR扩增结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

实施例1

本实施例是利用感染柑橘衰退病的柑橘叶片总RNA，将总RNA反转录后的cDNA稀释成不同浓度，再进行q-PCR扩增，分析引物的扩增效率。

1)RNA的提取：按照公知的方法提取感染柑橘衰退病的柑橘叶片总RNA；

2)反转录：反应体系为：RNA0.5μg，随机六聚体引物0.5μg，1mMdNTP5μL，M-MLV200U，5×M-MLVbuffer5μL，RNase20U，用RNA-free水补足至25μL。反应程序为：37℃45min，65℃10min。

3)cDNA的稀释浓度为80ng/μL的cDNA用RNA-free水进行5倍稀释。

4)RealTimePCR反应反应体系为SYBRMIX(BiO-rad170-8882AP)10μL，上下游引物(10μM)各0.4μL，模板cDNA2μL，ddH₂O7.2μL。反应程序为95℃5min,95℃5sec,55℃15sec,40个循环，在72℃采集荧光信号。

步骤4)中，所述上下游引物采用本发明之上游引物p23-F：CGTGGATTGYGGTAGAAA，下游引物p23-R：CTGAGAYTGYGTATTGTT。

对比例，步骤4)中，所述上下游引物分别采用ORF1，p25，p20和3’UTR基因的引物序列。

ORF1，p25，p20,3’UTR引物序列如下：

ORF15‘-AACGGGGTGACCAAGAC-3’

5‘-AACCGACACAGTTTAGTATAGC-3’

p255‘-AGCRGTTAAGAGTTCATCATTRC-3’

5‘-CRGTCCAAAGTTTGTCAGA-3’

p205‘-TATAGAGGCGAAACTGCGAAT-3’