[发明专利]一种基于对Rbmy基因进行编辑来实现动物性别控制的方法和应用

说明书

本发明公开了一种基于对Rbmy基因进行编辑来实现动物性别控制的方法和应用，该方法是通过利用CRISPR/Cas9系统特异性地切割Y染色体上的Rbmy基因来实现动物性别控制的。Rbmy基因编码一种生殖细胞特异的核蛋白，这种蛋白是与精子发生相关的一种重要因子，对Rbmy基因进行切割，可以使Rbmy基因丧失活性，进而使得Y精子或带有Y精子的受精卵丧失活性而无法发育为正常的胚胎，最终来提高雌性动物的出生比例，达到性别控制的目的。由此，可以通过该方法对动物后代出生的性别比例进行控制，以达到使具有更好的经济价值的雌性动物出生比例提高，从而大大提高生产效率和经济效应。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种基于对Rbmy基因进行编辑来实现动物性别控制的方法和应用。

背景技术

性别控制(Sex control)是指人为地干预动物的生殖过程，使得雌性动物生产出符合特定性别后代的一门技术。动物性别控制技术在预防人类遗传疾病、提高畜禽生产能力、动物遗传育种及濒危珍稀动物的保护等方面有着重要意义。

目前大约有300余种伴性遗传疾病与出生时婴儿的性别相关(如血友病、红绿色盲和遗传性肾炎等)，在妊娠早期利用性别控制技术可以预测伴性遗传病的发生情况，从而达到产前诊断预防疾病发生的目的。在动物生产上，为了获得更多的牛奶和禽蛋，需要更多地繁殖出雌性动物；为了获得鹿茸、麝香以及提高动物的生长速度，获得更多的肉类产品，需要大量的雄性动物。在动物遗传育种方面，性别控制技术可以减少育种年限，提高选育的效率，提供更多的终端父本及终端母本，同时可以预防奶牛由于异卵双生导致的不孕症。在拯救濒危保护动物方面，性别控制技术能够扩大保护动物的种群，提高雄性动物的利用率。

应用动物性别控制技术产生的社会价值以及经济价值都是巨大的，但是在动物生产中很难做到很好的性别控制效果。目前动物性别控制技术只在牛上有较为广泛的应用，要做到多种动物的大规模推广，还需要探索更为有效合理、更加成熟的方法。

CRISPR/Cas9基因组编辑技术，是指规律成簇间隔短回文重复序列(Clusteredregularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)是一种被发现存在于细菌及古生菌中，能够特异性地识别并降解入侵病毒或噬菌体携带的外源DNA的适应性免疫系统，其中II型CRISPR/Cas9系统是近年来应用于基因组编辑最热门的技术之一。目前CRISPR/Cas9系统已被广泛地应用于改造动物的细胞基因组，制作模式动物、植物，抵抗微生物以及人类医学上的疾病治疗、消除免疫排斥等各方面。CRISPR/Cas9的作用机理是由一个带特异性结合位点的单一导向RNA(single guide RNA，sgRNA)引导Cas9核酸酶到靶位点，在靶位点附近发生特异性地切割，最终DNA双链发生断裂或被修复或导致细胞死亡。

CRISPR/Cas9基因组编辑技术特异性地切割基因组的能力使得该技术应用于动物性别控制成为可能，根据CRISPR/Cas9系统的作用特点，只要针对动物的X或Y染色体保守序列设计多个切割位点，使X或Y染色体失活，使得雄性动物只产生一种类型的精子或使携带某种类型性染色体的受精卵无法正产发育，而达到动物性别控制的目的。但是关于CRISPR/Cas9系统对性染色体的基因编辑研究尚未见报道。

通过对小鼠性染色的深度测序，发现在小鼠的Y染色体上，有的基因拥有许多重复序列。这些多拷贝基因大多数来自于Y染色体的后天获得，主要有Sly、Ssty、Srsy，它们的拷贝数都在100个以上，且对应的等位基因拷贝数均在10个以上。这些基因多数只在雄性小鼠的生殖系里表达，与精子发生密切相关，敲除部分Y染色体长臂会导致这部分基因拷贝数减少，会造成精子的畸形甚至雄性不育，同时会增加雌性后代的出生比例。来自于祖先遗传的Y染色体多拷贝基因只有Rbmy一个基因，据估计它的拷贝数有30个，且它的等位基因Rbmx位于X染色体上，只有一个拷贝数。Rbmy基因只有6个基因座会发生转录，其中的两个基因座会翻译蛋白。Rbmy编码一种生殖细胞特异的核蛋白，这种蛋白是与精子发生相关的一种重要因子，另外Rbmy基因还与精子的能动性有关。