[发明专利]一种蛋白酶及其制备和应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程和生物酶技术领域，具体地涉及一种蛋白酶及其制备和应用。

背景技术

蛋白酶是催化蛋白质多肽链肽键水解的一类酶，其广泛存在于动植物和微生物中，由于其来源丰富，容易提纯，分子量小，功能简单等特点，使得蛋白酶在酶学研究中较早发展起来，同时也具有广泛的工业用途。到21世纪初，来源于微生物的蛋白酶已经被报道超过900种，生物体的正常生理活动和疾病的发生，如消化吸收、消炎、血压调节、机体衰老和癌症转移等都与蛋白酶有关。蛋白酶已经应用于洗涤、制革、饲料、食品、酿造、医药化工工业和环境资源的利用与开发等领域，有着广泛的用途，其在整个酶制品市场中占有重要的地位，蛋白酶生产总值达到整个酶制剂市场销售额的65％。

蛋白酶可以应用于洗涤工业，欧洲加酶洗衣粉所占的比例已经达到80％左右，全世界加酶洗衣粉在洗涤剂行业中也占有重要地位。在制革工业中蛋白酶也起着重要的作用，蛋白酶不作用胶原，而只能水解角蛋白、弹性蛋白和球蛋白等杂质，在浸水时可促进皮子吸水，脱毛时可分解毛皮与表皮间连接的类粘蛋白，使胶原纤维松散，使皮革更加柔软。蛋白酶也可以改性毛纺织物，省去以往处理过程中的化学试剂前处理，方法简单，经济环保。曹张军等利用假单胞菌(Pseudomonas)3096-4(保藏编号为CGMCCNo.3888)等微生物发酵得到一种复合酶，用该复合酶处理的毛或毛纺织物抗毡缩性和机械强度都有提高，适用于工业化生产(申请公布号：CN101935642A)。蛋白酶在食品工业上主要应用包括蛋白类食品发酵生产功能性低聚肽，烤焙食品，肉类嫩化和酒类澄清等。西方国家上市的蛋白酶大都来自可食用的微生物，来源安全。张翠翠等利用木瓜蛋白酶、复合蛋白酶和风味蛋白酶等进行复配，缩短了酶解时间，制备牛肉酶解物用于美拉德反应的反应物香气更加逼真，自然，口感舒适，口腔留香更持久，弥补了现有技术的缺陷(申请公布号：CN103266097A)。蛋白酶也可用于临床医药和保健，调节人体的功能，增强机体免疫，提高机体抵抗疾病的能力等。在生物体内的一些生理过程中它们起着极为重要和广泛的调控作用，临床上蛋白酶可用作消化剂、消炎剂、膳食补充剂和外科的清创剂等。它们在辅助缓解炎症反应和改善心脑血管代谢调节等方面有着重要作用，例如胰蛋白酶，已经广泛应用于心血管疾病医治和真菌基础性研究等领域。在可持续发展方面蛋白酶也有广泛的应用，利用蛋白酶可以水解一些蛋白质含量丰富的生物产品下脚料生产产品，变废为宝，保护环境。近年来环境污染日益加剧，环境问题越来越受到人们的关注，工业上使用对环境友好的生产工艺也成为未来工业发展的主流，为蛋白酶的应用创造了更加有利的条件。现如今基因工程技术及酶技术的快速发展使蛋白酶来源更廉价广泛，可以让蛋白酶应用到更多的领域中去。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于提供一种蛋白酶及其制备和应用，为蛋白酶的工业应用提供新品种。

本发明是通过如下技术方案来实现的：

一种蛋白酶，其核苷酸序列见SEQIDNO.1，该序列能编码上述蛋白酶。对该段核苷酸序列进行生物信息学分析，其中SEQIDNO.1中16-105位核苷酸序列编码的是信号肽，106-303位核苷酸序列编码的是连接肽，304-825位核苷酸序列编码的是活性蛋白。

进一步，所述蛋白酶的氨基酸序列见SEQIDNO.2。通过氨基酸序列对比及实验证实，该蛋白第一次被发现具有蛋白酶活性，为一种新型的金属蛋白酶。

本发明还涉及所述蛋白酶的制备方法，所述方法包括构建原核表达载体，利用超滤和离子交换方法纯化重组蛋白，表达载体为PET22b，所用的酶为NcoI和HindIII，其中特异性引物5’-CATGCCATGGATGCAAGTACAGGCAGTC-3’为PCR扩增反应的正向引物，5’-CCCAAGCTTATTTTATCTGTACCACGC-3’为相应的反向引物。以蛋白酶的DNA为模版，进行PCR扩增反应，获得带有酶切位点的目的片段，将目的基因与载体双酶切后连接，连接产物转化到感受态细胞E.coliBL21(DE3)中，涂布在Amp/LB琼脂固态培养基上培养，将长出的阳性克隆重组菌培养发酵，发酵液经离心通过超滤、硫酸铵沉淀、离子交换方法分离纯化得到重组蛋白。

本发明还涉及所述蛋白酶的具体制备方法，步骤如下：

1)采用特异的引物对编码蛋白的基因进行扩增，扩增的同时在引物上设计NcoI和HindIII的酶切位点，引物为：