[发明专利]一种基于核酸适配体的酶联免疫吸附技术检测石斑鱼虹彩病毒感染的方法

说明书

技术领域：

本发明属于石斑鱼虹彩病毒检测领域，具体涉及一种基于核酸适配体的酶联免疫 吸附技术检测石斑鱼虹彩病毒感染的方法。

背景技术：

石斑鱼是我国南方沿海各省以及东南亚各国最名贵的海水养殖鱼类之一，经济价 值极高。但近年来在石斑鱼中暴发和流行的石斑鱼虹彩病毒(Singaporegrouper iridovirus,SGIV)严重地威胁着石斑鱼的海水养殖，造成了巨大的经济损失。石斑鱼在被 SGIV感染后，会出现黑体、肝脾肾等组织器官坏死肿大，最终导致鱼体死亡。对于高密度养 殖的石斑鱼而言，能够在石斑鱼虹彩病毒感染的早期进行快速检测且操作简便的技术方 法，对于控制SGIV感染、减少损失至关重要。目前对于石斑鱼虹彩病毒诊断的方法主要包括 基于病毒学、组织病理学的传统方法，基于抗体的免疫学检测方法，以及分子生物学技术 等。尽管这些检测SGIV感染的方法具备高敏感性、高准确性的特点，但是由于试剂和实验仪 器昂贵，需要专业人员来操作且检测步骤繁琐，耗时长且试剂保存条件苛刻等缺点，导致这 些方法仅适用于实验室条件下的检测。因此亟需发展新型的高特异性、高灵敏性、操作简便 的技术来监测和控制石斑鱼虹彩病毒感染。

酶联免疫吸附技术(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)目前广泛应用 于有害微生物的检测。但是传统的基于抗体的ELISA检测技术具有一些不足，例如抗体需要 严格的低温保存条件以及抗体制备的耗时长、费用高、批次间质量存在差异，使用ELISA检 测时首先用一抗结合后还要带标记的二抗孵育，导致操作繁琐耗时长。因此，寻找抗体的替 代物并简化检测技术的操作流程成为优化ELISA技术的主要途径。指数富集的配基系统进 化技术(systematicevolutionofligandsbyexponentialenrichment，SELEX)是一类 广受关注的新型检测和治疗的生物文库技术。利用SELEX技术筛选得到的核酸适配体，即单 链DNA(ssDNA)或RNA，具有与单克隆抗体相当的高特异性和亲和性，方便保存和运输，温度 变化引起的变性是可逆的，筛选时间短费用低，可以重复使用，而且得到的核酸适配体在后 期易于合成和修饰。在先前的工作中，我们基于指数富集配基进化技术，以被虹彩病毒感染 的石斑鱼脾细胞为靶标进行筛选，获得了可以高特异性的识别虹彩SGIV感染的核酸适配 体。

发明内容：

为了克服现有的基于抗体的、检测病毒感染的酶联免疫吸附技术的不足，本发明 的目的是提供一种高特异性、高灵敏度、操作便捷、适用于在养殖场中使用的基于石斑鱼虹 彩病毒核酸适配体的酶联免疫吸附技术(Aptamer-basedenzyme-linkedapta-sorbent assays,Apt-ELISA)检测石斑鱼虹彩病毒感染的方法。

本发明的基于核酸适配体的酶联免疫吸附技术检测石斑鱼虹彩病毒感染的方法， 其特征在于，包括以下步骤：

(1)、将SEQIDNO.1～3所示的任意一条生物素标记的石斑鱼虹彩病毒核酸适配 体与待测样品进行结合，然后清洗；

(2)、将步骤(1)中结合了核酸适配体的样品进行离心，移除上清，将富集到的样品 与辣根过氧化物酶-链霉亲和素(HRP-streptavidin)混匀进行结合；

(3)、步骤(2)得到的结合了辣根过氧化物酶-链霉亲和素的样品进行清洗，然后移 入酶标板中，每孔加入TMB显色液避光反应，最后加入终止液终止反应；

(4)、检测待测样品在450nm处的吸光值，根据吸光值的变化来判断样品室是否被 石斑鱼虹彩病毒感染。

优选，步骤(1)的生物素标记的石斑鱼虹彩病毒核酸适配体与待测样品结合前先 进行复性，具体为：将生物素标记的核酸适配体在94℃高温变性10min，然后迅速插入到冰 中复性10min。

步骤(1)所述的核酸适配体与待测样品结合，优选，200nM的核酸适配体与200μl的 待测样品结合。

步骤(1)所述的结合，优选，结合时间为1～30min，结合温度为4～37℃。

步骤(1)所述的清洗，优选，用PBS清洗3次。

步骤(2)所述的辣根过氧化物酶-链霉亲和素，优选，辣根过氧化物酶：链霉亲和素 的体积比为1:10000，添加量为200μl，结合时间为15min。