[发明专利]构建基因组编辑正负筛选标记模板的方法及其应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及构建基因组编辑正负筛选标记模板的方法及其应用。

背景技术

工业微生物生产通常需要对菌株的基因组进行改造来改进其生产性能。例如，通过基因敲除、敲入或者替换经的方法修饰代谢通路或者改造基因调控原件经常可以提高目标产品的产量。在大肠杆菌，酿酒酵母或者枯草芽孢杆菌中进行遗传操作，为了筛选到重组子，需要筛选标记的帮助。为了实现复杂的优良性状，经常需要对多个基因进行顺序的操作，因此在一个基因编辑结束后，将筛选标记从基因组上移除，从而重复的利用一个标记进行多位点的操作就十分必要。

为了将正筛选标记从基因组上移除，利用位点特异性重组是最常用的方法。常用的位点特异性重组系统包括Cre/loxP系统、Xis/attP系统和FLP/frt系统。位点特异性重组系统可以高效的将一段序列高效的从基因组上消除，在大肠杆菌中甚至不需要负筛选编辑就可以获得消除菌株。然而这类方法的一个缺点是会在基因组上留下一个重组位点的疤痕，这个疤痕经常会对基因的表达造成影响。

为了实现无痕的基因组编辑，可以将一个负筛选标记与正筛选编辑连在一起，通过第二次重组将标记从基因组上移除。负筛选标记在特定条件下表达可以将菌株杀死，例如毒性基因就是一类常用的负筛选标记。在完成一轮基因组编辑之后，诱导毒性基因的表达，可以帮助筛选到消除标记的菌株。

发明内容

本发明要解决的技术问题：使用毒性基因进行基因组编辑的一个缺点是，其克隆通常比较困难，例如mazF基因是枯草芽孢杆菌中的一种常用的负筛选标记，但是据报道，它在大肠杆菌中的克隆比较困难，通常需要特定的载体才可以完成，增加了克隆的成本和难度。另外一些研究使用融合PCR的方法构建基因编辑模板，但是一般需要多轮的PCR过程才可以获得一个编辑模板，因此增加了PCR过程中引入突变的概率，也使构建过程更加的不稳定。

本发明的目的在于针对以上技术问题提供一种构建基因组编辑正负筛选标记模板的方 法，本发明要要解决的技术问题是，提供一种构建基因组编辑正负筛选标记模板的方法，使含有毒性基因(例如mazF基因)的编辑模板的构建更加快速方便。

本发明的另一目的在于提供上述构建基因组编辑正负筛选标记模板方法的应用。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种构建基因组编辑正负筛选标记模板的方法，包括以下步骤：

(1)将毒性基因从中间分成两部分，然后将前半部分毒性基因和后半部分毒性基因分别克隆入克隆载体，并将前半部分毒性基因与一个正筛选标记相结合，两部分毒性基因均加入了限制性内切酶位点和相匹配的粘性末端；

(2)将上下游同源臂分别克隆入克隆载体，并且在上同源臂的下游和下同源臂的上游加正向重复片段、限制性内切酶位点和相匹配的粘性末端；

(3)将步骤(1)制备的含有前半部分毒性基因的载体质粒、含有后半部分毒性基因的载体质粒和步骤(2)制备的分别含有上下游同源臂的载体质粒混合在一起，利用金门组装反应将两部分毒性基因片段和上下游同源臂共四个片段拼接在一起；

(4)将拼接产物做为PCR模板，扩增基因组编辑正负筛选标记模板的全长。

本发明方法中所述的毒性基因为mazF毒性基因，但不限于mazF毒性基因，对其他毒性基因的克隆也适用。

本发明方法中所述的限制性内切酶位点为BsaI酶切位点或TypeIIs酶切位点，但不限于上述酶切位点。

本发明方法中所述的正筛选标记为cat抗性基因、Amp抗性基因或Em抗性基因，但不限于上述的抗性基因。

上述的构建基因组编辑正负筛选标记模板的方法，其所述的克隆载体为pUC57载体。

上述的构建基因组编辑正负筛选标记模板的方法，具体包括以下步骤：

(1)将毒性基因mazF分成两部分mazF1和mazF2，然后将mazF1和mazF2分别克隆入克隆载体pUC57，并将mazF1与氯霉素抗性基因cat相结合，两部分毒性基因均加入了限制性内切酶位点和相匹配的粘性末端，构建了载体质粒pUC57-cat-mazF1和pUC57-mazF2；

(2)将上下游同源臂分别克隆在pUC57的载体上，并在上同源臂的下游和下同源臂的上游加正向重复片段、限制性内切酶位点和相匹配的粘性末端；