[发明专利]杀虫晶体蛋白、核酸、杀虫晶体蛋白的制备方法及其应用

说明书

本发明涉及杀虫晶体蛋白领域，特别涉及对甜菜夜蛾、水稻二化螟、亚洲玉米螟和小菜蛾有杀虫活性的Cry2类杀虫晶体蛋白。

技术领域

本发明涉及杀虫晶体蛋白领域，特别涉及对鳞翅目有杀虫活性的Cry2类杀虫晶体蛋白。

背景技术

到目前为止，已经发现了约600种的杀虫晶体蛋白，这些杀虫晶体蛋白主要来源于苏云金芽孢杆(Bacillus thuringiensis)。其对9个目500多种昆虫以及线虫、螨类和多种原生动物具有杀虫活性。由于Bt杀虫活性广泛并且与化学农药相比专一性高、安全性好、防治效果好、不污染环境等优点，已经成为目前世界上研究最多，应用最广、最成功的昆虫病原微生物，Bt杀虫剂占生物农药的70％以上，并已经应用于转基因植物，为人类带来很好的经济和生态效益，对其研究还在不断扩展和深入。

但是杀虫晶体蛋白的专一性强的特点是一把双刃剑。一方面其专一性强，意味着其对除目标害虫以外的生物，特别是人畜安全；但是另一方面也使得其杀虫谱过窄，对于多种害虫的综合防治来说，需要开发出针对不同害虫有效的杀虫晶体蛋白才能达到防治的目的。

然而，现有技术中仅发现苏云金芽孢杆菌的营养期杀虫蛋白(Vip蛋白，一种不同于杀虫晶体蛋白的蛋白)对甜菜夜蛾有较好的活性，而在杀虫晶体蛋白中至今还未发现能够对甜菜夜蛾等具有较好活性的蛋白。

因此，有必要从已知或新分离的苏云金芽孢杆菌菌株中寻找能够对甜菜夜蛾等有较好的活性杀虫晶体蛋白。

发明内容

本发明之一提供了一种杀虫晶体蛋白，其为Cry2类蛋白，所述Cry2类蛋白包括Cry2Aa17、Cry2Ab29、Cry2Ba2、Cry2Aa9、Cry2Ab4和Cry2Ah1中的至少一种；其中，所述Cry2Aa17的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，所述 Cry2Ab29的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，所述Cry2Ba2的氨基酸序列如 SEQ ID No.3所示；所述Cry2Aa9的氨基酸序列如SEQID No.4所示，所述 Cry2Ab4的氨基酸序列如SEQ ID No.5所示，所述Cry2Ah1的氨基酸序列如 SEQ ID No.6所示。

其中，由于氨基酸序列与杀虫活性之间并不是简单的一一对应关系，有的氨基酸序列高度同源但杀虫活性却有很大的不同。随着新基因的不断发现，一种基因具有两种或多种活性的情况不断被发现，为了避免杀虫谱和氨基酸序列的不一致性，Crickmore等提出了一种根据氨基酸序列同源性进行分类，形成了一个开放式分类系统，共分为四级，杀虫晶体蛋白氨基酸序列的同源性小于 45％为第一等级；在45％-78％之间为第二等级；在78％-95％之间为第三等级；同源性在95％以上为第四等级。其中第一、第四等级用阿拉伯数表示；第二、第三等级分别用大、小写英文字母表示。只要是来自Bt的伴胞晶体蛋白 (又称为杀虫晶体蛋白)，对目标生物具有毒性，或与已知的Cry或Cyt蛋白具有很高同源性，就可以纳入这一分类系统。按照Crickmore等提出的基因分类系统，Cry蛋白约70类，本发明的Cry2Aa17、Cry2Ab29、Cry2Ba2、 Cry2Aa9、Cry2Ab4和Cry2Ah1之间的同源性在45％-78％之间。

现有研究证实，杀虫晶体蛋白原毒素大小约130kDa，但其在130kDa大小的状态下并没有杀虫活性，而是必须经过蛋白酶等作用的切割，切割得到约52- 68kDa的蛋白后才能够发挥其活性。其中，所述的切割可以一般发生在有害生物的肠道之内，但也可以人为地有目的地改造为具有相同功能的52-68kDa的蛋白。