[发明专利]一种用于禽流感病毒通用型直接RT-PCR检测的引物和探针及试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及病毒检测技术领域，尤其涉及一种用于禽流感病毒通用型直接RT-PCR检测的引物和探针及试剂盒。

背景技术

禽流感(AvianInfluenza,AI)也叫欧洲鸡瘟或真性鸡瘟，是由A型流感病毒引起的一种急性高度接触性传染病，是国际公认的一种毁灭性疾病，可以经猪或其它动物传播给人，因此具有十分重要的生态学和公共卫生学意义，尤其是高致病性禽流感被世界动物卫生组织列为A类传染病。

近年来发现禽流感不仅严重危害禽类，而且危害哺乳动物，尤其是可以感染人并致人死亡，极大地威胁着人类公共卫生安全。禽流感病毒为单股副链RNA病毒，共分为8个节段。其中7节段即M基因全长为1027bp，编码2种蛋白M1和M2。在M基因编码的蛋白中，M1蛋白具有种群特异性，是病毒分类和诊断的基础。

目前，检测禽流感病毒的方法包括病毒的分离和培养和酶联免疫吸附(ELISA)等，但这些方法在灵敏性和特异性方面仍存在一定不足。反转录PCR(RT-PCR)技术由于灵敏性和特异性较高，已经成为禽流感病毒检测的常用方法。但常规RT-PCR需要进行后续电泳鉴定，易发生交叉污染而产生假阳性，且操作耗时较长。相比之下，荧光定量PCR技术(real-timeRT-PCR)具有更高的灵敏性，且无需PCR后续处理，能有效避免交叉污染并提高检测效率，然而进行病毒RNA提取不仅增加了时间和成本，难以实现高通量检测，而且提取RNA的过程仍容易发生RNA降解或交叉污染等事件，另外对于痕量样本，提取RNA仍存在较大困难。因此，现有的基于RT-PCR检测禽流感病毒的方法还有待于改进和发展。

为了提高禽流感病毒检测效率、节省成本、避免交叉污染并进行高通量检测，一种较好的解决方案是设法实现禽流感病毒直接扩增的RT-PCR检测，即直接以采集的液体样本作为检测对象进行RT-PCR反应。然而，受限于引物和探针易受样本复杂因素的影响，目前还没有找到可以这样使用的引物和探针。

发明内容

本发明提供一种用于禽流感病毒通用型直接荧光RT-PCR检测的引物和探针及试剂盒。采用本发明的引物和探针或试剂盒，并结合其它常规试剂组分，能够实现在一个PCR管中连续、自动进行病毒RNA的释放、反转录和荧光定量PCR检测；从得到检测样本到获得检测结果只需要1.5个小时；灵敏性、准确性可与传统RT-PCR相媲美；克服了传统RT-PCR需要提取RNA这一繁琐步骤的不足，减少操作步骤，提高检测速度，节省成本，有效避免交叉污染，能进行禽流感病毒的高通量检测，对快速发现禽流感疫情，及时制定防控措施具有重要的意义。

根据本发明的第一方面，本发明提供一种用于禽流感病毒通用型直接扩增的RT-PCR检测的引物和探针序列，包括：

一对禽流感病毒的检测引物，其序列如SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示；

一条禽流感病毒的检测探针，其序列如SEQIDNO:3所示；该序列的3’端结合荧光淬灭基团，5’端结合荧光报告基团；

一条内标RNA的探针，其序列如SEQIDNO:4所示；该序列的3’端结合荧光淬灭基团，5’端结合荧光报告基团。

作为本发明的优选方案，上述探针SEQIDNO:3的3’端结合BHQ1(BlackHoleQuencher-1，黑洞淬灭染料-1)荧光淬灭基团，5’端结合FAM(6-carboxy-fluorescein，6-羧基荧光素)荧光报告基团；上述探针SEQIDNO:4的3’端结合BHQ3荧光淬灭基团，5’端结合CY5荧光报告基团。

根据本发明的第二方面，本发明提供一种用于禽流感病毒通用型直接扩增的RT-PCR检测的试剂盒，包括检测引物、检测探针和内标探针，上述检测引物的序列如SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示，上述检测探针的序列如SEQIDNO:3所示，该序列的3’端结合荧光淬灭基团，5’端结合荧光报告基团；上述内标探针如SEQIDNO:4所示，该序列的3’端结合荧光淬灭基团，5’端结合荧光报告基团。

作为本发明的优选方案，上述探针SEQIDNO:3的3’端结合有BHQ1荧光淬灭基团，5’端结合有FAM荧光报告基团；上述探针SEQIDNO:4的3’端结合BHQ3荧光淬灭基团，5’端结合CY5荧光报告基团。

作为本发明的优选方案，上述试剂盒包括禽流感病毒通用型内标溶液；优选地，上述内标溶液通过将禽流感病毒通用型M基因克隆至RNA假病毒表达载体pAR中并将得到的质粒pAR-AIVUN通过大肠杆菌转化的方法制备。