[发明专利]一种产碱杆菌荧光定量的试剂盒及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及医学检验技术领域，具体涉及一种产碱杆菌荧光定量的试剂盒及其应 用。

背景技术

产碱杆菌是一种条件致病菌，是一种革兰染色阴性杆菌，常在有水的环境中生存， 主要来自潮湿环境，如雾化器、呼吸机和灌洗液等。临床分离最常见的是粪产碱杆菌，大部 分感染是条件致病，血、痰、尿、脑脊液等是常见的发现部位，是医院感染的病原菌之一。由 于该菌对许多抗菌药具有天然的耐药性，以及随着广谱抗菌药物的滥用和侵入性医疗操作 的开展，该细菌导致的机会性感染逐渐增多，死亡率高达15％～48％。但现在的检测方法还 比较落后，主要是采用镜检、分离培养和生化检测，其检测效果并不理想，准确度差且耗时 长。

荧光PCR技术在1995年由美国PE公司率先研制成功，它兼有PCR的高灵敏性、DNA杂 交的特异性和光谱技术精确定量的优点，结果直观，能直接检测PCR过程中的变化。与普通 PCR相比，其结果可实时观察，产物不需要凝胶电泳检测，完全闭管操作，有效地降低了污 染。

发明内容

本发明需要解决的现有技术的问题是：产碱杆菌感染早期诊断困难，现有技术的 诊断产品和诊断方法敏感性低、阳性率低，导致病情延误。

为了解决上述问题，本发明提供了产碱杆菌荧光定量PCR试剂盒，用来解决现有的 产碱杆菌感染诊断困难，敏感性低、阳性率低的问题。本发明采用先进的分子诊断方法，采 用荧光PCR法早期、快速、简便、敏感、特异检测产碱杆菌。

具体而言，本发明提供了一种用于产碱杆菌荧光定量的试剂盒，包括用于产碱杆 菌定量检测的特异性引物序列SEQIDNo.1和SEQIDNo.2，以及特异性探针序列SEQID No.3。

优选的，所述试剂盒还包括阳性标准品，所述阳性标准品中包含有插入了产碱杆 菌特异性DNA序列SEQIDNo.4的重组质粒。

优选的，所述重组质粒的浓度为1.0×10³～1.0×10⁷拷贝数。

优选的，用于所述特异性DNA序列SEQIDNo.4扩增的引物序列为SEQIDNo.5和 SEQIDNo.6。

优选的，所述试剂盒还包括阴性标准品，所述阴性标准品包含有不含产碱杆菌特 异性DNA序列的质粒。

优选的，所述的质粒或重组质粒相同，选自pETs、pUCs、pGM-T、pBR322、pMD-T中的 一种，优选为pGM-T、pBR322。

优选的，所述的试剂盒还包括缓冲液、DNA聚合酶和dNTPs。

优选的，所述的缓冲液包括三羟甲基氨基甲烷、氯化钾和氯化镁。

优选的，所述的三羟甲基氨基甲烷的浓度为50～200mM；氯化钾的浓度为300～ 800mM；氯化镁的浓度为10～30mM。

更优选的，所述的三羟甲基氨基甲烷的浓度为100～150mM；氯化钾的浓度400～ 600mM；氯化镁的浓度为10～20mM。

优选的，所述特异性探针为带有荧光基团和淬灭基团的特异性序列，其中，所述的 荧光基团选自FAM、HEX、TET、VIC中的一种，优选为FAM、VIC；所述的淬灭基团选自MGB、 TAMRA、BHQ中的一种，优选为MGB。

同时，本发明提供了特异性引物序列SEQIDNo.1和SEQIDNo.2，以及特异性探 针序列SEQIDNo.3在制备产碱杆菌含量测定和/或检测用试剂中的应用。

优选的，所述的产碱杆菌含量测定和/或检测用试剂的使用方法如下：

分别在阳性标准品组、阴性标准品组以及样品DNA组中加入用于产碱杆菌定量检 测的特异性引物序列SEQIDNo.1、SEQIDNo.2和特异性探针序列SEQIDNo.3以及DNA聚 合酶，混合均匀后进行荧光定量PCR反应。

优选的，所述的荧光定量PCR反应条件为：94～95℃预变性2～5min，1个循环；94 ～95℃15～20s、55～60℃30～50s，40～50个循环。

其中，所述的质粒可以为本领域常用的任何可插入外源基因的质粒，可以为常见 的pETs系列、pUCs系列、pBR322、pGM-T等，pUCs系列优选为pUC18、pUC19等。

其中，特异性引物与特异性探针根据产碱杆菌高度保守序列特性设计，用于检测 产碱杆菌。