[发明专利]一种鉴别NADC30-like PRRSV的PCR检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于动物疾病快速检测技术领域，涉及一种用于NADC30-likePRRSV的PCR 检测试剂盒及其检测方法。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征（俗称猪蓝耳病）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductiveandrespiratorysyndromevirus，PRRSV）引起的一种猪烈性传染病，临床 主要表现为母猪流产、死胎或者生长育肥各阶段猪群呼吸道症状。我国于1996年报道了该 病的发生，并分离出病毒；随着2006年猪的无名高热症暴发，给养猪业带来了巨大的经济损 失。

当前，由于动物及其产品的不断输入，NADC30PRRSV也在随着不断地分离到，与国 内高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（HP-PRRSV）重组变异，演化为NADC30-likePRRSV新 毒株，已经在我国河南、河北、山西、四川、广西、广东等地区流行，且呈现出进一步扩散和蔓 延趋势。NADC30-likePRRSV与其他流行PRRSV最大区别在于Nsp2区域缺失了393个核苷酸。 由于NADC30-likePRRSV毒力变化快、不同类型毒株间临床症状接近，且易与其他病原混合 感染等原因，使得临床诊断困难；因此快速准确的鉴别检测NADC30-likePRRSV，制订合理 的预防控制措施，成为防控该病关键。

发明内容

本发明公开了一种用于鉴别猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒的特异性引物，其特征 在于它的上游引物序列为：5-ATGTTGTGCTTCCTGGGGTTG-3，

下游引物序列为：5-CTTGACAGGGAGCTGCTTGA-3

所述的猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒包括：HP-PRRSV，Classical-PRRSV，NADC30-like PRRSV。

本发明进一步公开了用于鉴别猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒的PCR检测试剂盒， 所述试剂盒主要包括特异性引物、PCRBuffer、dNTPs、rTaq酶、Marker及阳性和阴性标准 品，其引物序列为：

上游引物序列为（Nsp2-F）：5-ATGTTGTGCTTCCTGGGGTTG-3，

下游引物序列为（Nsp2-R）：5-CTTGACAGGGAGCTGCTTGA-3。

本发明更进一步公开了采用NADC30-likePRRSV的PCR检测试剂盒检测方法，主要 包括：

（1）提取待测样品的核酸；

（2）以特异性引物对检测样品进行PCR扩增反应；

（3）扩增反应结束后，进行琼脂糖凝胶电泳；

（4）观察电泳检测图，根据特异性目的条带判定结果。

电泳图中如出现628bp特异性条带，表明该样品感染NADC30-LikePRRSV，如果出 现931bp特异性条带，表明该样品感染HP-PRRSV。如果出现1021bp特异性条带，表明该样品 感染Classical-PRRSV；如果出现多种特异条带，表明该样品混合感染相应类型病毒。

本发明更进一步公开了用于鉴别猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒的特异性引物的 PCR试剂盒在进行鉴别NADC30-likePRRSV病毒方面的应用。

实验的结果表明：本发明涉及的引物不仅能够检测NADC30-likePRRSV，而且能够 同时检测HP-PRRSV，Classical-PRRSV，另外，本发明还能够检测2类及以上PRRSV病毒混合 感染（具体例子见图3临床样品应用检测，其中17号就为NADC30-PRRSV和HP-PRRSV混合感 染）。

本发明更加详细的描述如下：

一、材料与方法

1、毒株与临床样品

PRRSVNADC30-like（TJnh株）由天津市畜牧兽医研究所分离鉴定并保存；HP-PRRSV （TJM-F92株）购自新疆天康畜牧生物技术股份有限公司；Classical-PRRSV（VR2332株）购自 勃林格殷格翰药业有限公司。

样品为疑似PRRSV感染病猪的肺脏及淋巴结，均采自于天津及周边发病猪场。

2、阳性标准品

以PRRSV的Nsp2基因（NCBI登录号为JN654459.1）为模板，以Nsp2-F与Nsp2-R为引物进 行扩增反应，将扩增反应获得的特异性扩增片段，分别连接到T克隆载体上，构成的重组质 粒。