[发明专利]一种基于Northern杂交检测家蚕microRNA的方法

说明书

技术领域

本申请属于生物遗传领域，具体地说，涉及一种基于Northern 杂交检测家蚕microRNA的方法。

背景技术

印迹技术是将生物大分子从凝胶转移到一种固定基质上的过 程，由Southern最先于1975年建立，用以研究DNA图谱，也称 作Southern杂交。之后，许多研究者应用Southern杂交技术开展 研究。1977年，Alwine等首次运用印迹技术检测RNA，这种与 DNA印迹技术相对应的RNA印迹技术被称为Northern印迹杂交 (Northernblot)。Northern杂交只需要利用一段单链cDNA分子 探针便可以检测和测量不同长度的RNA分子，所以很快就得到 了广泛运用。1993年，Lee等运用Northern杂交技术鉴定了第1 条miRNA，即线虫(Caenorhabditiselegans)的lin-4；2000年， Reinhar等、Pasquinelli等利用Northern杂交技术在线虫和果蝇 (Drosophilamelanogaster)中发现了第2条miRNA，即let-7。 2001年，有3个实验室通过Northern杂交和克隆测序鉴定了线虫、 果绳以及哺乳动物中的200多条miRNA，开启了miRNA研究的 新时代。作者于2007年首先利用Northern杂交技术对家蚕miRNA let-7进行了鉴定和表达研究，随后又利用该技术与miRNA芯片 对预测的90多条家蚕miRNAs进行了鉴定和时空表达谱分析。 Northern杂交曾被认为是miRNA鉴定的金标准。然而，由于 Northern杂交的过程长，操作步骤繁多，加之miRNA自身存在分 子短小和表达量低等特点，因此一些很重要的操作细节即可能直 接影响到实验的成败，要得到miRNA的高质量Northern杂交图 并不容易。

发明内容

有鉴于此，本申请针对现有技术中存在Northern杂交的过程长， 操作步骤繁多的问题，提供了一种基于Northern杂交检测家蚕 microRNA的方法，适合于鉴定家蚕miRNA和其他小RNA，而且 对其他物种的miRNA及其靶基因鉴定也有一定参考价值。

为了解决上述技术问题，本申请公开了一种基于Northern杂交检 测家蚕microRNA的方法，包括以下步骤：

1)RNA的分离纯化；

2)探针与Marker的放射性标记和标记产物纯化；

3)制胶和电泳；

4)转膜与RNA分子的交联固定；

5)预杂交和杂交；

6)洗杂交膜和低温放射自显影；

7)杂交探针的剥脱与膜的再利用。

进一步地，RNA的分离纯化具体按照以下步骤实施：

(1)180℃烘研钵2h，待冷却至室温后放于-20℃冰箱中预冷；

(2)分装Trizol至1.5mL离心管中，1mL/支；

(3)将100μg家蚕组织材料在冰上研磨至白色粉末，需要加3 次液氮；

(4)将粉末转到Trizol中，用移液枪枪头吹吸数次至无明显块 状，静置5min；

(5)加入300μL氯仿，用力振荡混匀20s，静置10min；

(6)4℃条件下12000r/min离心20min，转移上清液约600μL， 加入100μLPEG6000-NaCl混合溶液，15％PEG6000，2mol/LNaCl， 轻轻颠倒混匀，冰上静置10min；

(7)4℃条件下10000r/min离心15min，将上层液体转移到无 RNA酶的1.5mL离心管中，计量液体的体积；

(8)离心管中依次加入1/10体积的pH5.2、3mol/LNaAc、4μ LDNAmate，颠倒数次混匀，再加入2.5倍体积的无水乙醇，轻轻颠 倒数次混匀，-20℃静置2h以上；

(9)4℃条件下13000r/min离心10min，小心将液体倒在废液缸 中，用500μL75％乙醇洗沉淀1次，4℃条件下10000r/min离心2min， 倒掉液体，将残留液体吸出；

(10)在无菌操作台上将沉淀自然风干，时间为5min或在真空 干燥箱中干燥至微透明，时间为2min；