[发明专利]利用TR-FRET高效筛选单克隆抗体阳性克隆的方法

说明书

技术领域

本发明是一种在单克隆抗体制备过程中，高效率、高阳性率筛选阳性克隆的方法。TR-FRET (Time-ResolvedFluorescenceResonanceEnergyTransfer，时间分辨荧光共振能量转移)技术是一种均相检 测方法，无需包被微孔板，无需洗板，极大节省工作量和时间。

背景技术

目前，国内外生物科研试剂和生物制药相关行业，在制备单克隆抗体时，主要利用ELISA(酶联 免疫吸附实验)或者FACS(流式细胞术)筛选阳性克隆。ELISA的实验原理本身存在着一些难以克服的 缺点：1.需要包被微孔板、封闭，需要多次洗板；2.步骤多，容易引起误差，实验重复性低；时间长，需 要一天时间；3.包被抗原蛋白容易破坏蛋白构象，屏蔽部分抗原表位，导致假阳性率、假阴性率较高。FACS 因为通量较低，实验步骤多，操作复杂，也不利于高通量、高效率的进行克隆筛选。

TR-FRET中文全称时间分辨荧光共振能量转移，该技术结合了荧光共振能量转移(FRET， FluorescenceResonanceEnergyTransfer)和时间分辨荧光(TRF，Time-ResolvedFluorescence))两种技术。 FRET技术利用了两种荧光基团的能量转移，这两种荧光基团分别称为能量供体(Donor，有铕或铽两种) 和能量受体(Acceptor，有XL665或d2两种)，前者的发射光谱与后者的激发光谱重叠。Donor被外来能源 激发(例如闪光灯或激光)，如果它与Acceptor在足够近的距离之内，可以将能量共振转移到Acceptor上。 Acceptor受到激发，发出特定波长的发射光。

将Donor和Acceptor分别偶联在相互作用的两个生物分子上，生物分子的结合可以将Donor和 Acceptor拉近距离，产生能量转移。由于Acceptor分子的发射光来自于能量转移，所以在实验中无需将未结 合与已结合的分子分开，可实现均相检测。

TRF技术是利用稀土元素中镧系元素铕(Eu)或铽(Tb)的独特性质，其荧光比普通荧光持续时 间更长。普通荧光的半衰期为纳秒级，镧系元素的半衰期为毫秒级，有6个数量级的差别。所以在检测时， TRF有一个时间延迟～100微秒，从而使反应体系内普通背景荧光信号几乎为零。因此TRF的背景非常低， 反映样品实际情况。

TR-FRET技术的Donor有两种，一种是铕穴状化合物(Eu³⁺cryptate)或Lumi4^TM铽穴状化合物(Tb²⁺cryptate)，另一种是铕螯合物(Eu³⁺Chelate)或Lumi4^TM铽螯合物(Tb²⁺Chelate)。铕和铽受激光激发后， 其发射波谱在620nm处有一波峰。Acceptor也有两种，一种是XL665，为6个APC铰链复合体，分子量大于 100kD，另外一种是d2，是个小分子化合物，分子量约1kD。XL665和d2受激后会在665nm处形成一特异 波峰。

TR-FRET技术优势：

a)操作简单：加入样品和检测试剂，孵育后即可上机读值；

b)省时省力：无需包被、洗板，2个小时内完成实验；

c)灵敏度高，线性范围广：检测下限可达pg/mL级别，上限可达ug/mL级别；

d)实验数据稳定可靠：7天内可随时检测，荧光信号无明显下降；

e)假阳性、假阴性率较低：均相检测，无需包被，不破坏蛋白构象；

f)通量高，易小型化：384孔板操作，反应体系最小可达4uL。

发明内容

本发明开发了一种在单克隆抗体制备过程中，利用TR-FRET技术进行阳性克隆筛选的方法，可以 替代传统的ELISA和FACS方法，实现了短时间内高通量筛选，而且有效降低了假阳性率和假阴性率，为 单克隆抗体生产提供了一种简单、快速、高效的筛选方法。

本发明的利用TR-FRET高效筛选单克隆抗体阳性克隆的方法，实验步骤如下：

1)在96孔微孔板中培养经过亚克隆筛选的单克隆杂交瘤细胞株或已经转染表达目的抗体的单克 隆细胞株。

2)37℃培养5-10天，当细胞铺满孔板面积80％时，进行换液，继续培养一天。