[发明专利]人工诱导铁皮石斛在组培瓶内开花的方法

说明书

技术领域

本发明涉及植物组织培养技术领域，具体涉及一种人工诱导铁皮石斛在组培瓶内开花的方法。

背景技术

铁皮石斛（Dendrobiumofficinale）又称黑节草，为兰科植物石斛属多年生草本植物。铁皮石斛是石斛中的极品，是著名的观赏兼药用兰花，铁皮石斛花朵也是市场上奇货可居的具有保健作用的名贵花茶原材料。然而在自然环境下，由于其对生境条件要求苛刻，铁皮石斛难开花、开花周期长、花量少，成为铁皮石斛花茶和花卉产业开发的瓶颈难题。因此，人工诱导铁皮石斛植株峰量开花对铁皮石斛花茶和花卉产业有着重要的商业价值，同时对研究铁皮石斛开花机理也有重要的意义。而现有的应用生物技术对诱导铁皮石斛开花的技术体系，虽可获得一定的开花诱导率，但有毒物质残留、成本高等问题大大限制了其市场推广价值。

如中国专利CN102577963B公开的一种诱导铁皮石斛开花的方法，包括以下步骤：采用铁皮石斛茎段离体培养的原球茎为试验材料，进行壮苗培养50~80d，再经过诱导开花阶段I—诱导开花阶段II—诱导开花阶段I的交替培养诱导后，进入开花培养阶段。在诱导开花阶段I中，培养基I为：1/2MS基本培养基+PP3330.50~1.50mg/L+ABA0.5~1.0mg/L，使用了PP333作为植物生长调节剂。又如中国专利CN103210842B公开的一种铁皮石斛试管开花及结实的方法，采用铁皮石斛茎段或铁皮石斛蒴果（铁皮石斛蒴果为合生心皮的复雌蕊发育成的果实，子房1室或多室，每室有多粒铁皮石斛种子）作为外植体进行诱导培养，再经原球茎增殖培养、原球茎生根培养、生根苗诱导开花培养及授粉过程及结实培养后，形成试管花及试管果实。在生根苗诱导开花培养时，将生根苗接种于下列诱导开花培养基中：MS+白糖30~60g/L+琼脂粉5.5~11g/L+土豆30~50g/L+BA0.2~0.6mg/L+NAA0.1~0.9mg/L+PPP3330.3~0.8mg/L+Spm1.0~6.0mmol/L+ZT1.5~6mg/L，其中也使用到了PP333。PP333又叫多效唑，是一种植物生长调节剂，具有延缓植物生长，抑制茎杆伸长，缩短节间、促进植物分蘖、增加植物抗逆性能，提高产量等效果。但多效唑在植物中代谢慢，易产生残留超标的问题，且它对人体和环境的危害，目前已经被证实。因而食用多效唑诱导的花茶，易让人们产生安全性的焦虑。

有鉴于此，现有技术需要提供一种新的人工诱导铁皮石斛在开花的方法，使铁皮石斛的开花率提高，但又不产生药物残留的问题。

发明内容

本发明意在提供一种铁皮石斛在组培瓶内开花的方法，以解决现有技术的铁皮石斛开花率低、有害化合物残留的问题。

本发明中一种人工诱导铁皮石斛在组培瓶内开花的方法，包括以下步骤：

步骤1）：外植体的灭菌消毒：用无菌水将铁皮石斛蒴果表面的脏物冲洗干净，将铁皮石斛蒴果置于75%乙醇中浸15s，再放入0.1%的升汞溶液中浸15min后，用无菌水冲洗4～5次，每次冲洗5min，备用；

步骤2）：无菌萌发及幼苗生长：用无菌滤纸擦干蒴果表面水后，切开蒴果，将种子取出接种于萌发培养基中，萌发培养基为1/2MS固体培养基添加0.2～1.0mg/L萘乙酸、6.5～8.5g/L琼脂、15～30g/L蔗糖；接种后摇动，使种子均匀散布于培养基中，封口，将接种后的组培瓶移入培养室，培养温度22～28℃，光强1200～2000lx、相对湿度65～80%、每天光照11～16h，5～8d后种子开始萌发，30~45d后长成2～3cm的幼苗；

步骤3）：生根壮苗培养：将步骤2）中的幼苗转接至生根壮苗培养基中；壮苗培养基为1/2MS固体培养基添加3.5～4.5mg/L萘乙酸、0～10%土豆、6.5～8.5g/L琼脂、15～30g/L蔗糖；在温度22～28℃，光强1200～2000lx、相对湿度65～80%、光照14～16h/d，60～80d后长成成苗；

步骤4）：诱导开花：将步骤3）中的成苗转接至开花培养基中，开花培养基为1/2MS固体培养基添加0.8～2.0mg/L萘乙酸、5～10%椰汁、0～10%土豆、0～10%香蕉、6.5～8.5g/L琼脂、15～30g/L蔗糖；在温度25～30℃，光强1500～2500lx、相对湿度65～80%、光照14～16h/d；诱导35～50d后得到开花苗；