[发明专利]检测TERT基因启动子C250T、C228T突变位点的方法、引物和试剂盒

说明书

技术领域

本发明属生命科学和生物技术领域，特别涉及检测TERT基因启动子C250T、C228T 突变位点的引物、方法和试剂盒。

背景技术

脑胶质瘤(glioma)是神经系统中最为常见的原发性恶性肿瘤。已进行的临床和基 础研究都证明脑胶质瘤预后极差，无法控制的肿瘤细胞增殖、减慢的肿瘤细胞凋亡速度、肿 瘤细胞的侵袭性以及新生血管生长等恶性肿瘤生物学特征使得脑胶质瘤的治疗面临巨大 的困难。人端粒酶是肿瘤标志物之一，在肿瘤发生、发展过程中，端粒酶的活化起着重要的 作用。端粒酶由端粒酶RNA、端粒酶相关蛋白、端粒酶逆转录酶(TERT)组成。TERT被认为是端 粒酶活性的关键决定因子，它可以延长由于细胞分裂不断缩短的端粒，从而使细胞获得永 生，只在端粒酶阳性肿瘤组织和永生化细胞中表达。

近年来，通过全基因组测序，发现TERT基因启动子突变在脑胶质瘤患者中非常常 见，且TERT的表达量水平升高。文献报道TERT基因启动子存在C228T和C250T两个突变热点， 在2级与3级脑胶质瘤患者中的发生率分别为10％，在4级脑胶质瘤患者中的发生率分别为 74％。

本发明采用Touch-downPCR扩增和Sanger测序法检测TERT基因启动子C250T、 C228T的突变，并且所设计的扩增引物的扩增产物可以涵盖启动子中包括C250T和C228T在 内的所有突变位点。Touch-downPCR扩增可确保正、反向扩增引物与样本DNA模板的结合发 生在互补性最强的序列之间，当退火温度降低到非特异性扩增发生的水平时，特异性扩增 产物在此时已经有一个几何数的起始优势，丰度较高，在剩余的扩增反应中，特异性扩增产 物与非特异扩增产物产生竞争，但是因非特异性扩增产物丰度较低，特异性扩增产物始终 优先扩增，从而产生单一的占主导地位的特异性扩增产物。而Sanger测序法是检测基因突 变的金标准，检测结果准确性高，并且很大程度上地节省了检测成本。

发明内容

本发明的目的在于提供检测TERT基因启动子C228T、C250T突变位点的引物，所述 引物包括扩增TERT基因启动子C228T、C250T突变位点的正、反向引物，其碱基序列为：

TERT-F：AAGGAAGGGGAGGGGCTGGG

TERT-R：CGACCTCTCTCCGCTGGGGC。

进一步地，所述引物还包括一对测序引物，其碱基序列为：

TERT-S-F：AAGGAAGGGGAGGGGCTGGG

TERT-S-R：CGACCTCTCTCCGCTGGGGC。

进一步地，所述正、反向引物的使用浓度比为：TERT-F:TERT-R＝1:1。

进一步地，所述一对测序引物的使用浓度比为：TERT-S-F:TERT-S-R＝1:1。

进一步地，所述正、反向扩增引物的扩增反应条件为：第一阶段，95℃预变性 10min；第二阶段，变性温度94℃30sec，退火温度64℃90sec，延伸温度72℃30sec，循环16 次，每循环一次，所述退火温度降低0.5℃；第三阶段，变性温度94℃30sec，退火温度58℃ 30sec，延伸温度72℃30sec，循环24次；第四阶段，72℃10min；第五阶段，扩增反应结束，扩 增产物在4℃下保存。

本发明的目的在于还提供一种检测TERT基因启动子C228T、C250T突变位点的方 法，其包括如下步骤：

(1)提取样本DNA；

(2)利用一对扩增引物TERT-F和TERT-R对(1)中的DNA进行扩增，获得扩增产物；

(3)利用一对测序引物TERT-S-F和TERT-S-R对(2)中的扩增产物进行测序，获得所 述扩增产物的碱基序列；

(4)将(3)中的碱基序列与TERT基因启动子野生型参考序列TERT-ref进行比较，确 定突变位点是否存在，所述扩增引物和测序引物序列分别为：

TERT-F：AAGGAAGGGGAGGGGCTGGG

TERT-R：CGACCTCTCTCCGCTGGGGC

TERT-S-F：AAGGAAGGGGAGGGGCTGGG

TERT-S-R：CGACCTCTCTCCGCTGGGGC。