[发明专利]一种线粒体靶向的亚硝酰氢分子荧光探针及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种线粒体靶向的亚硝酰氢分子荧光探针及其制备方法和应用，属于分析化学技术领域。

背景技术

研究表明，亚硝酰氢(HNO)在生物体内许多生理过程中起着重要的作用。例如HNO可以增强心脏细胞的收缩，可以在肌肉组织中可以增加血管的扩张以及减少血小板的凝聚等效果。在非血管细胞中，HNO是已知的能够阻止脂质过氧化，从而促进血红素氧化酶的表达。此外研究表明，HNO可以通过触发具有电压依赖性的K⁺通道，促进动脉的松弛。通过动物实验发现，HNO不仅可以增强小鼠心肌肌丝的伸缩能量，同时可以增加Ca²⁺在小鼠心肌里的吸收。然而HNO在体内含量的异常可能会对机体有较大的损害，例如HNO的氧化产物具有较强的氧化能量，可以破坏细胞内的DNA链。此外，大量的HNO可能会引起神经细胞的凋亡。在细胞内的细胞器水平上，线粒体与HNO有着密切的联系，有文献报道，线粒体中的细胞色素c能够将NO转化成HNO，HNO的产生可能与线粒体的功效有着重要的联系。此外，线粒体中的一些酶的功效可能会被HNO所抑制，因此，对细胞线粒体的HNO的检测十分必要并具有重要的意义。

发明内容

针对目前还没有对细胞线粒体中的HNO进行检测的荧光探针，本发明通过分子设计，合成出一种具有良好选择性以及线粒体体靶向性的HNO荧光探针。

本发明还提供了上述线粒体靶向的亚硝酰氢分子荧光探针的其制备方法和应用。

本发明采用以下技术方案：

一种线粒体靶向的亚硝酰氢分子荧光探针，其特征在于，所述荧光探针的结构式如式(Ⅰ)所示，简记为化合物Mito-HN：

一种上述的亚硝酰氢分子荧光探针的制备方法，其特征在于，它包括以下步骤：

1)将2′,4′-二羟基-2-苯酮苯甲酸与间羟基苯基哌嗪在三氟乙酸中，氮气保护，90℃加热回流，反应24h，反应结束后减压旋干溶剂得粗产品，然后用硅胶柱分离得到化合物MHN-1，结构式如下：

2)将步骤1)所得化合物MHN-1溶于乙腈中，加碳酸氢钠后再加入Fmoc-Cl，氮气保护，室温反应3h，反应完全后萃取、干燥、旋干并用硅胶柱分离得到化合物MHN-2，所述MHN-2和Fmoc-Cl的结构式分别如下：

3)将化合物二苯基磷苯甲酸溶于二氯甲烷中，加入二环己基碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶后在室温下搅拌20min后加入化合物MHN-2，在室温下搅拌8h，反应完全后萃取、干燥、旋干并用硅胶柱分离得到化合物MHN-3，结构式如下：

4)将化合物MHN-3溶于乙腈，然后逐滴加入15％的哌啶，在室温下搅拌30min，反应完全后，加入水淬灭反应，然后用二氯甲烷分两次萃取，依次用水、饱和食盐水洗涤后干燥、旋干溶剂，并用硅胶柱进行分离得到化合物MHN-4，结构式如下：

5)将化合物MHN-4溶于DMF中，加入K₂CO₃后在室温下搅拌10min，加入三苯基膦丁基溴后在室温下反应过夜，用TLC板检测反应，反应完全后分离提纯得到目标探针化合物Mito-HN。

本发明荧光探针的合成路线如下：

所述步骤1)中硅胶柱分离洗脱剂配比为甲醇：二氯甲烷＝1:5。

所述步骤2)中萃取剂为乙酸乙酯，干燥剂为无水硫酸钠，硅胶柱洗脱剂配比为甲醇/二氯甲烷＝1:30。

所述步骤3)中萃取剂为乙酸乙酯，干燥剂为无水硫酸钠，硅胶柱洗脱剂配比为甲醇：二氯甲烷＝1:50。

所述步骤4)中干燥剂为无水硫酸钠，硅胶柱洗脱剂配比为甲醇/二氯甲烷＝1:30。

所述步骤5)中分离提纯的具体方法为：将反应产物用乙酸乙酯稀释，水洗2次，饱和食盐水洗涤2次，无水硫酸钠干燥，减压旋干溶剂得粗产品，并用硅胶柱进行分离，洗脱剂配比为甲醇：二氯甲烷＝1:20。

本发明HNO探针的用途：该荧光探针可以应用于水环境和生物细胞体系中HNO的传感检测；所述的传感检测包含荧光检测，目视定性检测，细胞成像检测。

本发明的有益效果是：

(1)首次合成针对细胞线粒体中的HNO分子进行检测的荧光探针，该探针的合成相对比较容易，产率较高，且后处理过程相对简单。

(2)本发明实现了HNO分子探针的选择性快速检测，并且选择性好，抗其他分子干扰能力强。