[发明专利]表达重组蛋白G的细菌磁颗粒及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及纳米磁珠应用和医学检测领域，具体是涉及表达重组蛋白G的细菌磁颗粒及其应用。

背景技术

细菌磁颗粒是趋磁细菌生产的一种磁性纳米颗粒，内核是Fe₃O₄晶体，外面有一层磷脂生物膜包被，粒径在30-120nm之间。同一种趋磁细菌生产的细菌磁颗粒粒径大小和晶体晶型基本一致，磁学性质均一，有天然生物膜包被，具有很好的水溶性质和胶体性质。此外，因为细菌磁颗粒是生物来源，因此具有较好的生物相容性。细菌磁颗粒膜上带有大量的氨基基团，可通过化学修饰和双功能偶联剂连接不同的功能大分子，如抗体，从而具有不同的独特功能。

细菌磁颗粒最独特的地方在于它可以通过基因工程的方法在细菌磁颗粒膜上表达特殊的蛋白质，通过和细菌磁颗粒膜上锚定蛋白的融合表达，功能性的靶蛋白可以在细菌磁颗粒上展示出来。相比化学修饰的方法，这种生物学功能修饰的好处和优势更加显而易见。因此，细菌磁颗粒作为一种新型的微生物来源纳米磁珠材料，在生物医学和纳米材料领域具有广泛的应用前景。

链球菌蛋白G(Streptococcus Protein G,SPG)是在A、C和G群链球菌的细胞壁上发现的一种能够和人及多种哺乳动物的IgG相结合的蛋白质，它同IgG的亲和力强，结合谱广，在免疫学和免疫化学上有着广泛的应用。重组的蛋白G去除了天然的蛋白G与其他诸如白蛋白、Fab抗体段结合的位点，可特异性结合IgG抗体的Fc区段。

抗人球蛋白试验，又称为Coombs试验(库姆试验)，是检测血型不规则抗体IgG的重要依据。血型抗体有IgG和IgM两类，其中的IgM抗体在盐水介质中能与含相应抗原的红细胞发生肉眼可见的凝集反应。而IgG抗体只能致敏红细胞，不能使其凝集，因此需要通过抗人球蛋白抗体作为第二抗体，将致敏红细胞表面的IgG连接起来才能使得红细胞发生凝集。在自动化检测中，抗人球蛋白试验需要结合微柱凝胶卡来使用，随着微柱凝胶卡的成本越来越高，一定程度上增加了常规试验和血型抗体筛查中抗人球试验的成本。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供一种表达重组蛋白G的细菌磁颗粒及其应用。本发明利用重组蛋白G作为第二抗体，替代抗人球试验中的抗人球抗体试剂；利用细菌磁颗粒的磁特性，在外加磁场的作用下可以帮助致敏红细胞凝集，一方面最大限度减少细菌磁颗粒的使用量，另一方面最大限度提高低效价IgG抗体的检测敏感性。

本发明具体技术方案如下：

本发明一方面提供了表达重组蛋白G的细菌磁颗粒在用于血型不规则抗体IgG的检测中的应用。

本发明另一方面提供一种表达重组蛋白G的细菌磁颗粒，该表达重组蛋白G的细菌磁颗粒是对趋磁细菌MSR-1重组株进行扩大培养、分离纯化得到的。

进一步的改进，该重组蛋白G的序列是：

进一步的改进，本发明提供述趋磁细菌MSR-1重组株是通过如下方法构建而成的：

a.构建细菌磁颗粒膜蛋白mamC/mamF基因缺失的趋磁细菌MSR-1突变株；

b.构建细菌磁颗粒膜蛋白融合表达质粒；

c.将功能化细菌磁颗粒融合表达质粒通过接合转入到步骤a制得的趋磁细菌MSR-1突变株，构建趋磁细菌MSR-1重组株。

本发明另一方面提供一种表达重组蛋白G的细菌磁颗粒的制备方法，该方法包括如下步骤：

a.构建细菌磁颗粒膜蛋白mamC/mamF基因缺失的趋磁细菌MSR-1突变株；

b.构建功能化细菌磁颗粒膜蛋白融合表达质粒；

c.将功能化细菌磁颗粒融合表达质粒通过接合转入到步骤a制得的趋磁细菌MSR-1突变株，构建趋磁细菌MSR-1重组株；

d.对趋磁细菌MSR-1重组株进行培养；

e.分离纯化，制得功能化细菌磁颗粒。

进一步的改进，步骤a所述构建细菌磁颗粒膜蛋白mamC/mamF基因缺失的趋磁细菌MSR-1突变株的具体方法为：

(a)扩增细菌磁颗粒膜蛋白mamC/mamF基因左右两侧共两个长均为700-1000bp的同源片段；左右两同源片段均带有两个酶切位点；

(b)左右同源片段分别用相应的限制性内切酶进行双酶切；同时对自杀质粒pKmobsacB进行双酶切；

(c)将经过双酶切后的左右同源片段和经过双酶切后的自杀质粒pKmobsacB进行连接，连接产物转到E.coli感受态细胞中，挑选连接正确的阳性克隆菌；